温度对克氏原螯虾胚胎和幼体发育的影响

刘永鑫，张殿福，陶忠虎，付峰，顾泽茂

1.华中农业大学水产学院/华中农业大学双水双绿研究院/湖北省水生动物病害防控工程技术研究中心/教育部长江经济带大宗水生生物产业绿色发展工程研究中心，武汉 430070； 2.湖北省潜江市农业事业发展中心，潜江 433100； 3.湖北省潜江市农业农村局，潜江 433100

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)俗称小龙虾，是一种重要的淡水经济虾类，具有掘洞、爬行等生物学习性，能有效利用稻田空间、稻秆和水资源进行繁育与生长，与水稻构成了和谐的生态系统，形成“双水双绿”种养体系[1]。因此，兴起于21世纪初的“虾稻共作”模式，近年来在我国发展迅速，2019年全国克氏原螯虾稻田种养面积达110.59万 hm2，产量177.25万 t[2]。然而，克氏原螯虾产业在快速发展的过程中，苗种供应成为最大难题。早期克氏原螯虾的苗种主要为捕捞湖泊和沟渠的野生苗，后期主要通过稻田投放种虾或留种育苗，这种稻田育苗方式难以满足大面积扩张过程中的苗种需求，很多地方出现了“一苗难求”的现象[3]。

温度是影响虾类生长发育的重要环境因子之一，确定克氏原螯虾苗种孵化的适宜温度，是人工繁育所必需掌握的生物学基础。关于温度对克氏原螯虾繁殖与发育的影响，已有一些报道[4-7]，但对胚胎和幼体发育的适宜温度范围研究结果不一致，同时，缺乏不同温度下的成活率数据。笔者比较了不同温度下克氏原螯虾胚胎和幼体的发育速率和成活率，系统观察了克氏原螯虾胚胎和幼体发育时期的形态变化，以期补充克氏原螯虾的发育生物学数据，为稻田繁育虾苗提供技术支撑，并在实践操作中指导养殖户通过调节水温提早繁育虾苗。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试验设计

试验用克氏原螯虾亲虾采自监利县双水双绿示范基地，体质量(25.02±1.05) g。在室内进行人工交配，每天观察亲虾繁殖情况，发现抱卵虾及时取出。试验用水为曝气24 h的自来水，溶氧量保持在(8.0±0.5) mg/L，氨氮水平(0.02±0.01) mg/L，pH 8.0～8.5。试验容器为60 cm×40 cm×20 cm的塑料水槽，加热棒控制水温。

设置19、22、25、28 ℃ 4个温度处理组，温差不超过±0.5 ℃。每个温度梯度放12尾抱卵虾，其中6尾用于胚胎和幼体发育成活率的计算，6尾用于发育过程的跟踪观察[8]。水槽中始终保持20 L试验用水。增氧泵持续向水槽充气，每2 d换1次水，每次换水体的1/2，换同等水温的曝气水。

1.2 样本采集与观察

采集抱卵虾的受精卵，根据胚胎发育情况，抱卵初期每2 h取样观察1次；胚胎发育到囊胚期之后每4 h取样观察1次；胚胎进入原肠胚和器官发生期后，每12 h取样观察1次。每次取表层卵5～8粒，在体视显微镜(Leica M205 FA)下观察拍照，记录各期发育特征。每天早、晚各检查1次，清除死卵。幼体全部孵出后，统计胚胎的孵化时间和孵化率，孵化时间为半数幼体出膜的时间。

幼虾出膜后每12 h观察1次，直至卵黄囊消失。每次每个重复随机取样3～5尾，在体视显微镜(Olympus SZX16)下观察拍照，记录幼体形态特征。每天早、晚各检查1次，清除死虾，幼虾死亡以心脏停止跳动为准。统计幼体阶段的发育时间和成活率，发育时间为半数幼体到达该期的时间。

1.3 数据统计分析与计算

胚胎孵化率(RH,%)、幼体从孵化到Ⅳ期的成活率(RⅣ,%)、生物学零度(C, ℃)及有效积温(K,℃·h)采用以下公式计算：

RH=(NM/NE) ×100%

RⅣ=(NⅣ/N0) ×100%

K=t(T-C)

式中，NE为亲本怀卵量；NM为幼体孵化总量；NⅣ为Ⅳ期幼体数量；N0为试验开始时幼体总数；t为发育时间；v为发育速率(1/N)；T为平均水温，℃；C为发育的生物学零度，℃[9]。

试验数据均表示为平均值±标准差(Mean±SD)，利用SPSS 26.0对数据进行单因素方差分析和多重比较，以P<0.05表示差异显著。数据之间的关系采用统计作图软件GraphPad 8.0进行曲线拟合分析。

2 结果与分析

2.1 温度对胚胎发育的影响

1)胚胎发育分期。参照堵南山[10]对螯虾类胚胎发育的分期，将克氏原螯虾胚胎发育过程分为Ⅰ～Ⅵ期6个阶段(图1)。各期主要特征如下：Ⅰ期(受精卵期)：胚胎呈球形，不透明，质膜紧贴，卵质表面没有隆起(图1-1)；Ⅱ期(卵裂期)：质膜分离，颜色略有加深(图1-2)；Ⅲ期(囊胚期)：卵黄表面分裂，形成放射状排列的初级卵黄锥体，卵中央部分不分裂，即为中央质(图1-3、1-4)；Ⅳ期(原肠胚和器官发生期)：细胞开始凹陷，胚孔形成，2对视叶原基出现(图1-5、1-6、1-7)；Ⅴ期(卵内无节幼体期)：2对触角原基与3对颚足原基相继形成，开始出现淡黄色的囊状心脏(图1-8、1-9)；Ⅵ期(卵内蚤状幼体期)：胸肢和腹肢原基陆续出现，复眼形成，心跳频率增加且节律趋于稳定(图1-10、1-11、1-12)。

2)温度对胚胎孵化率的影响。在试验温度(19～28 ℃)范围内，克氏原螯虾胚胎均能正常孵化。温度对孵化率有显著影响(P<0.05，表1)，随着温度的升高，孵化率呈现“先升后降”的趋势，水温22 ℃时孵化率最高，为91.03%±2.97%；水温28 ℃时孵化率最低，为40.53%±4.97%，且显著低于其他3组(P<0.05)。温度(T)与孵化率(RH)的关系可以用二项方程式较好地拟合：RH=-1.515T2+ 66.83T- 641.5，R2=0.935 0(P<0.01，图2)，根据曲线拟合方程计算得出22.06 ℃时孵化率最高。

3)温度对胚胎发育持续时间的影响。由表2可知，温度对克氏原螯虾胚胎各阶段发育时间均有显著影响(P<0.05)，同一温度不同胚胎阶段历时也不相同。其中，原肠胚和器官发生期历时最长，为(111.33±3.01)～(205.33±3.27) h，占32.20%～33.01%；卵内蚤状幼体期是耗时第二长的阶段，占29.13%～29.27%；卵内无节幼体时期耗时略低于前两者，占22.70%～25.24%，其他几个阶段耗时都比较少，总和不超过胚胎发育总时间的15%。整体来看，在19～28 ℃内，胚胎发育速率随温度的升高而加快，水温19 ℃时的孵化时间最长，为(622.67±6.02) h；水温28 ℃时，孵化时间最短，为(349.67±4.63) h。温度(T)与孵化时间(D)的关系可以用二项方程式较好地拟合：D=0.1709T2-9.254T+139.9，R2=0.984 9(P<0.01，图3)，根据曲线拟合方程计算得出，27.07 ℃时胚胎孵化速度最快。

1.受精卵； 2. 卵裂期； 3～4.囊胚期； 5～7. 原肠胚和器官发生期； 8～9. 卵内无节幼体期； 10～12. 卵内蚤状幼体期。 CM：中央质； OLP：视叶原基； D：胚孔；AP：触角原基； H：心脏； OL：视叶； CE：复眼。 标尺：1 mm。1. Zygote; 2. Cleavage stage; 3-4. Blastula stage; 5-7. Gastrula and organogenesis stage; 8-9. Nauplius stage; 10-12. Zoea stage. CM:Central mass; OLP:Optic-lobe primordium; D:Gastrula with dent; AP:Antenna-primordium; H:Heart; OL:Optic lobe; CE:Compound eyes. Scalebars are 1 mm.

表1 不同温度下克氏原螯虾孵化率和幼体成活率 Table 1 Hatching rate and larval survival rate of Procambarus clarkii at different temperature

图2 克氏原螯虾孵化率和水温的关系Fig.2 The relationship between hatching rate and water temperature

图3 克氏原螯虾孵化时间和水温的关系Fig.3 The relationship between hatchingtime and water temperature

4)胚胎发育的生物学零度及温度与有效积温的关系。采用Sanderson-Pearis公式，计算得出克氏原螯虾胚胎发育的生物学零度为7.32 ℃，即水温低于7.32 ℃，胚胎停止发育。将C=7.32代入公式K=t(T-C)中，计算不同温度下胚胎发育的有效积温，由表2可知，温度对其有显著影响(P<0.05)，在试验温度(19～28 ℃)范围内，随温度的升高，胚胎发育的有效积温“先降后升”，水温22 ℃时所需要的有效积温最低，为(6 494.58±150.21) ℃·h。

表2 不同温度下克氏原螯虾胚胎各阶段的发育时间 Table 2 Development time of embryo stages of Procambarus clarkii at different temperatures

2.2 温度对幼体发育的影响

1)幼体发育分期。根据其外部形态特征，将克氏原螯虾幼体发育阶段分为4个时期(图4)。各期主要特征如下：Ⅰ期幼体，即刚破膜的幼体，头胸部充满卵黄，无眼柄；胸肢5对，不具摄食能力；腹肢4对，较成体少1对；尾部不能打开；附肢均无刚毛(图4A)。Ⅰ期幼体经1次蜕壳后为Ⅱ期幼体，该时期眼柄出现，头胸部卵黄囊呈“U”型，随发育进程会逐渐缩小呈“V”型；胸肢开始具备摄食能力；附肢边缘开始长出刚毛(图4B)。幼体第2次蜕壳后进入Ⅲ期幼体发育阶段，头胸部卵黄囊呈“V”型，随发育进程会逐渐消失；第一胸足螯钳能自由张合，可有效捕食和抵御小型生物；第1、2触角环节数增加，尾部可自由张合(图4C)。幼体第3次蜕壳后进入Ⅳ期幼体发育阶段，该时期眼柄发育已基本成形，头胸部卵黄囊消失；第一腹肢出现，腹肢变为5对，布满刚毛；头胸甲壳颜色变深，肉眼已看不到腹内消化道(图4D)。此时幼体已基本完成了外部结构的发育，之后便开始进入仔虾发育阶段。

A.Ⅰ期幼体； B.Ⅱ期幼体； C.Ⅲ期幼体； D.Ⅳ期幼体. 标尺：1 mm。 A.Larval stageⅠ; B.Larval stage Ⅱ; C.Larval stage Ⅲ; D.Larval stage Ⅳ. Scalebars are 1 mm.

2)温度对幼体成活率的影响。在试验温度(19～28 ℃)范围内，克氏原螯虾幼体成活率均可达80%以上。由图5可知，幼体成活率随温度的升高呈现“先升后降”的趋势。水温22 ℃时，幼体成活率最高，为94.37%±1.60%；水温28 ℃时，幼体成活率最低，为82.67%±1.51%，且各温度组幼体成活率差异显著(P<0.05，表1)。温度(T)与幼体成活率(RⅣ)的关系可以用二项方程式较好地拟合：RⅣ=-0.4111T2+ 18.73T-119.9，R2=0.838 4(P<0.01，图5)，根据曲线拟合方程计算得出22.78 ℃时幼体成活率最高。

图5 克氏原螯虾幼体成活率和水温的关系Fig.5 The relationship between larval survivalrate and water temperature

3)温度对幼体发育持续时间的影响。由表3可知，温度对克氏原螯虾幼体各阶段发育时间均有显著影响(P<0.05)，同一温度不同幼体阶段历时也不相同。其中，Ⅲ期幼体发育持续时间最长，为(76.00±6.20)～(120.00±6.20) h，占38.68%～39.84%；Ⅱ期幼体发育次之，占31.96%～33.02%；Ⅰ期幼体发育持续时间最短，占27.63%～29.25%。整体来看，在试验温度(19～28 ℃)范围内，温度对幼体发育速度有显著影响(P<0.05)。水温19 ℃时，幼体发育时间最长，为(304.00±10.73) h；水温28 ℃时，幼体发育时间最短，为(194.00±9.03) h。温度(T)与发育时间(D)的关系可以用二项方程式较好地拟合：D=0.03472T2- 2.151T+ 41.05，R2=0.966 2(P<0.01，图6)，根据曲线拟合方程计算得出，30.98 ℃时幼体发育最快。

4)幼体发育的生物学零度及温度与有效积温的关系。采用Sanderson-Pearis公式，计算得出克氏原螯虾幼体发育的生物学零度为3.29 ℃，即水温低于3.29 ℃，幼体停止发育。将C=3.29代入公式K=t(T-C)中，计算不同温度对应的幼体发育有效积温，由表3可知，在试验温度范围内，温度对幼体发育有效积温无显著影响(P>0.05)。

表3 不同温度下克氏原螯虾幼体各阶段的发育时间 Table 3 Development time of larvae stages of Procambarus clarkii at different temperatures

图6 克氏原螯虾幼体发育时间和水温的关系Fig.6 The relationship between larval developmenttime and water temperature

3 讨 论

3.1 温度对克氏原螯虾胚胎发育的影响

在胚胎发育过程中，卵黄物质为主要营养来源，升温可增强卵黄蛋白降解酶的活性，继而促进相关代谢活动，加快胚胎发育速度[11-12]。韩晓磊等[6]的研究发现，30 ℃时克氏原螯虾胚胎(抱卵)发育仅需15 d；在Jin等[7]的温度梯度试验中，克氏原螯虾胚胎(抱卵)孵化用时随温度升高逐渐缩短，水温25 ℃下仅需21 d；而吕佳等[4]的研究表明，在12～39 ℃条件下，孵化时间随温度升高“先减小后增加”，33 ℃时用时最短，为29 d。本研究中，在19～28 ℃温度范围内，孵化时间随温度的升高而缩短，水温19 ℃时的孵化时间最长，水温28 ℃时孵化时间最短。这与韩晓磊等[6]和Jin等[7]的研究结果较一致；但与吕佳等[4]的研究结果相比，本研究中相同温度下的孵化速度较快。分析其原因可能与抱卵的方式有很大关系，即抱卵虾胚胎的孵化速度和孵化率远高于非抱卵胚胎[13]。

不同虾类种群对温度的耐受也不同，当水温超过温度耐受范围时，胚胎发育异常甚至死亡[14-15]。日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)胚胎在36 ℃以上温度条件下不能正常孵化[16]；脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)胚胎在温度超过30 ℃时不能正常发育[8]；红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)受精卵在水温低于22 ℃或超过35 ℃时，均不能正常孵化[17]。本研究中，在试验温度(19～ 28 ℃)范围内，克氏原螯虾胚胎均能正常孵化，孵化率随着温度的升高呈现先升高后降低的趋势，在水温22 ℃时达到最高，但在28 ℃时胚胎孵化率仅为40.53%，显著低于其他温度组。这可能是因为胚胎内某些卵黄降解酶的活性在高温时受到抑制，从而导致了胚胎出现畸形，甚至死亡[18-19]，也可能是由于高温使克氏原螯虾抱卵刚毛黏附性降低，卵散落于水体底部后因缺氧而死亡，具体原因仍需进一步深入研究。

3.2 温度对克氏原螯虾幼体发育的影响

温度对克氏原螯虾幼体的生长和存活有明显的影响[5-6]。本试验在水温19～28 ℃条件下，幼体发育速度随温度升高而加快，这与李铭等[5]在一定温度范围内高温可明显促进克氏原螯虾幼体发育的结论一致，也与研究脊尾白虾[20]、中国对虾(Penaeuschinensis)[21]以及凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[22]等的结果一致。但当环境温度超过了动物自身的调节能力时，会导致生长受限，死亡率升高[23-24]。脊尾白虾在36 ℃高温时幼体无法正常变态为仔虾[20]；日本沼虾在31 ℃高温时幼体死亡率高达88%[25]；墨吉明对虾(Fenneropenaeusmerguiensis)幼虾在温度低于14 ℃的水中，停止摄食，24 h后全部死亡[26]。李铭等[5]的研究中克氏原螯虾在31 ℃条件下，死亡率很高，3～4周后全部死亡。本研究中，在19～28 ℃温度范围内，克氏原螯虾幼体均可正常发育，成活率随温度升高“先上升后下降”，水温22 ℃时成活率最高。与马盛群等[25]、李铭等[5]的研究结果相比，幼体成活率相对较高，分析其原因可能与虾自身的体质和母体“热史”有关。在本研究中，高温(28 ℃)条件下，幼体成活率显著降低，这可能是因为高温加快了新陈代谢速率，自身营养物质的积累难以满足代谢消耗，从而导致幼体无法完成生长蜕壳，最后死亡[27]。

本试验中还发现，同一温度胚胎和幼体时期成活率明显不同，幼体对温度的耐受范围要高于胚胎。这可能与机体自身营养供给有很大关系，Ⅱ～Ⅲ期幼体可开口摄食水体中小型浮游生物，从而为高温条件下机体较快的新陈代谢提供能量，而胚胎时期的能量消耗只能靠自身卵黄物质提供。综合各项指标，我们建议克氏原螯虾人工繁育过程中胚胎和幼体发育的温度范围设为22～25 ℃。