生物炭对烤烟成熟期土壤养分及根际细菌群落结构的影响

杨焕焕,李茂森,王丽渊, 冯慧琳,刘福童,杜君,任天宝,高卫锴

1.河南农业大学河南省生物炭研究工程技术中心，郑州 450002； 2.河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所/河南省农业生态与环境重点实验室，郑州 450002； 3.江西省烟草公司宜春市公司，宜春 336000； 4.广东中烟工业有限责任公司，广州 510032

植烟土壤的质量直接决定了烟叶的质量[1-2]。近些年来，由于大量化肥和农药的施用，土壤养分失衡、次生盐渍化和酸化现象严重，病原菌不断积累，土壤质量和生态环境不断恶化，烤烟成熟期的耐熟性和成熟度受到了很大的影响，造成烟叶品质下降，这些问题给烟草的可持续发展带来了极大的挑战[3]。土壤微生物是土壤物质循环和能量流动的参与者和驱动者，在土壤环境中具有重要地位[4]，其对土壤环境具有极强的敏感性，可以作为评价人为干扰土壤质量变化的指标之一[5]。

生物炭是生物质在低氧条件下，经高温裂解产生的一种性质稳定的富碳物质[6]。生物炭表面孔隙丰富，有极大的电荷密度和比表面积，生物炭富含活性基团，具有较强的阳离子交换能力，在土壤修复领域发挥着重要的作用[7-9]。生物炭在自然条件下呈碱性，施入土壤后可以提高酸性土壤pH。冯慧琳等[10]研究了生物炭对土壤酶活和细菌群落的影响及其作用机制，生物炭施用后土壤容重降低，pH值、速效磷、速效钾、有机质含量和碳氮比均升高，且细菌多样性显著提升，尤其是增加了芽单胞菌门和变形菌门等促生菌的丰度。阎海涛等[11]研究发现施加生物炭3 a后显著提高了土壤pH、含水率、总有机碳(TOC)和总氮(TN)含量,而降低了土壤容重和溶解性有机碳(DOC)含量。曲晶晶等[12]研究发现，在土壤中施加秸秆炭可以提高土壤pH和团聚体数量，并且环境因子的改变驱动土壤微生物群落的生态演替。生物炭通过改变土壤的理化性质，增加活性炭源和改善土壤水分环境，从而影响土壤微生物的群落结构[13-14]。在土壤中添加生物炭能显著改变微生物的丰度和群落结构[15]，随着生物炭施用量的增加，土壤中各类微生物的丰度和群落结构均显著提高[16-18]，生物炭施加到土壤后可以在短期内富集微生物类群[19]。

烤烟成熟期是影响烟叶质量的关键时期，因此，探究生物炭对烤烟成熟期烟株根际土壤细菌群落结构和土壤养分变化规律对优质烟叶生产具有重要的意义。本试验在江西宜春烟区进行，在植烟土壤中添加生物炭，采用高通量技术分析了土壤细菌群落结构和土壤养分变化规律，以期为烤烟土壤微生态的调控和我国优质烟叶生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020年在江西宜春上高烟区进行，该烟区为烟稻轮作，植烟土壤均为砂壤土。土壤基本理化性质为：土壤pH值5.52，全碳、全氮、全硫含量分别为1.37%、0.17%、0.073%，有机质含量为2.31%，碱解氮为97.25 mg/kg，土壤速效磷为25.54 mg/kg，土壤速效钾105.40 mg/kg。生物炭原料为花生壳，理化性质为：比表面积(按过 0.85 mm 孔径筛计) 16.71 m2/g，容重 0.21 g/cm3，pH 9.05，含碳 465.3 g/kg，全氮 8.30 g/kg，全硫0.83 g/kg，孔体积0.029 m2/g。

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计，共设置2组处理，每组处理设3次重复，小区长20 m，宽10 m。CK：常规施肥(纯氮为145.0 kg/hm2，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)= 1∶1∶3)，T：750 kg/hm2生物炭+常规施肥。4月23日之前将生物炭施入烟田，生物炭料和常规肥作为基肥一次性施入植烟土壤，施肥方式为条施。各处理的移栽方法、水肥管理、农事操作与非试验田管理一致。

1.3 供试土壤与样品采集

烤烟生长到成熟期第75天时，根据 5点取样法确定取样点，每个处理取5株烟株根际土壤，收集完成后混匀，一部分保存在 10 mL无菌离心管中，干冰保存，用于进行微生物多样性检测，一部分于-4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物量的检测。最后一部分在阴凉处自然风干后研磨，分别过0.85、0.25和0.15 mm筛后于阴凉处保存，进行土壤理化性质分析。

1.4 土壤理化指标及养分测定

参照文献[20]测定土壤理化性质，对样点做平行组。pH的测定采用超纯水做浸提剂，按照土水质量比1∶2.5浸提，用精密pH计(型号：IS128C)测定；采用火焰光度计法测定土壤速效钾；土壤有机碳采用浓硫酸-重铬酸钾外加热法测定；土壤速效磷采用碳酸氢钠浸提法测定；土壤全碳、全氮、全硫含量采用碳氮硫元素分析仪(Vario MAX CNS，德国)测定；碱解氮采用碱解扩散法；微生物量碳氮(MBC、MBN)采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法测定[10]。

1.5 烟叶化学成分测定

烟叶常规化学成分(总氮、烟碱、蛋白质、总糖、还原糖、钾、氯)采用流动分析仪( AutoAnalyzer3) 测定，分别参照YC/T 161—2002《烟草及烟草制品总氮的测定》、YC/T 160—2002《烟草及烟草制品总植物碱的测定》、YC/T 249—2008《烟草及烟草制品蛋白质的测定》、YC/T 159—2002《烟草及烟草制品水溶性糖的测定》、YC/T 217—2007《烟草及烟草制品钾的测定》和YC/T 162—2002《烟草及烟草制品氯的测定进行》。

1.6 土壤微生物检测

使用E.Z.N.A.©soil试剂盒 (OMEGA)提取土壤DNA，利用NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司)检测DNA纯度；检测合格后，用用338F和806R引物进行扩增[21-22]。

使用琼脂糖回收盒回收PCR产物，混合后送往IlluminaMiSeq平台平台进行基因序列测定(上海美吉生物医药科技有限公司)。

1.7 数据分析

使用Excel 2016整理数据，方差分析采用最小显著性差异法以SPSS 22.0软件分析处理数据，用 R软件的 vegan包进行绘图。

2 结果与分析

2.1 生物炭对烤烟农艺性状的影响

如图1所示，添加生物炭后烟株株高和中部叶叶宽在移栽后65、85、105 d均大于对照处理，且均达到显著性差异，株高在3个时期分别提高了3.27%、0.42%和0.63%，生物炭处理烟株中部叶叶宽较对照分别提高了4.15%、4.96%和5.13%。添加生物炭处理茎围与对照组相比无显著提高。生物炭处理在移栽后65 d和105 d中部叶叶长较对照分别显著提高了2.12%和1.96%，表明施加生物炭有利于促进烟株生长。

不同小写字母表示在0.05水平存在显著性差异。Different letter means significantly different at 0.05 probability level.图1 生物炭对烟株不同生育期农艺性状的影响Fig.1 Effects of biochar on agronomic traits of tobacco at different growth stages

2.2 生物炭对土壤主要营养指标的影响

试验结果(表1)显示，与CK相比，施加生物炭的土壤pH显著提高了9.48%，土壤碱解氮含量提高了10.11%，但与CK没有显著差异；施加生物炭处理土壤速效钾、速效磷和有机碳含量较CK分别提高了11.14%、7.90%和11.76%，均与CK存在显著差异。说明添加有机碳可以显著提高土壤pH和养分含量。

表1 不同处理土壤化学性质 Table 1 Soil chemical properties of different treatments

2.3 生物炭对土壤细菌多样性的影响

1)生物炭对根际土壤细菌α多样性的影响。对10个土壤样本进行细菌检测(图2)，共获得有效序列573 285条。样品测序覆盖度为98.11%，测序数据量合理。依据97%序列相似性对所测序列进行聚类分析，10个样本产生2 459～3 002个OTU，样本平均OTU数为2 860.5。施肥与对照处理共有OTU数3 842，与CK相比，施加生物炭处理处理土壤OUT数提高了2.28%。

对土壤细菌多样性指数(表2)进行分析，CK和T的Shannon指数分别是6.52和6.60，施加生物炭处理ACE指数和Chao指数高于CK处理，表明施加生物炭对土壤微生物群落有一定影响。

2)生物炭对根际土壤细菌群落组成的影响。细菌群落组成测定结果表明，所有样本中门水平上共获得细菌群落44个。如图3所示，丰度较高的门种类分别为放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)，相对丰度分别为26.41%～32.43%、22.32%～34.62%、7.86%～15.18%、6.08%～13.99%和3.07%～7.85%，平均相对丰度分别为29.39%、26.65%、12.76%、11.43%和4.37%。其中优势菌为放线菌门、变形菌门、绿弯菌门和酸杆菌门，其相对丰度之和占所有可注释菌的84.58%以上。

生物炭对不同门细菌丰度的影响不同。对施加生物炭处理和对照土壤样品中细菌群落的相对丰度进行t检验，结果(图4)显示，与CK相比，生物炭处理的绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)丰度分别提高了1.82%、12.36%和64.55%；放线菌门(Actinobacteriota)和变形菌门(Proteobacteria)丰度分别降低了2.02%和9.00%。此外，在非优势种群中，Myxococcota和Desulfobacterota丰度与对照相比有显著提高(P<0.05)，而Bacteroidota和Patescibacteria丰度与对照相比显著降低(P<0.05)。

图2 所有样品细菌群落OTUsFig.2 OTUs numbers of bacterial and fungal communities in all samples

表2 细菌群落测序数据和α多样性 Table 2 Sequencing data and α diversity of the bacterial community

图3 所有样本中细菌门水平上的物种相对丰度Fig.3 Relative abundance of species at phylum level in all samples

图4 不同处理组门水平上优势细菌相对丰度Fig.4 Relative abundance of dominant bacteria at phylum level in different treatment groups

3)生物炭对根际土壤微生物β多样性的影响。对样本距离矩阵进行聚类分析，构建样本层级聚类树，可以准确表述不同样本的相似性和差异关系。从图5A可以看出，与对照相比，施加生物炭的样本可以完全聚类在一起，且与对照相隔较远，表明根际微生物区系在朝一定的方向发生变化，施加生物炭能够显著改变烟株根系微生物区系结构。基于OTUs丰度的土壤菌落结构主成分分析结果如图5B所示，PC1轴和PC2轴对样本组成差异的贡献值分别为52.30%和14.08%，从图5B可以看出，施加生物炭的处理与对照处理样本点在PC1轴上有较明显的分离，说明生物炭对土壤细菌群落结构产生了一定的影响。

A:层级聚类树 Hierarchical clustering tree on OTU level; B:主成分分析 Principal component analysis.图5 生物炭施用对烤烟根际土壤细菌β多样性Fig.5 Effects of biochar on diversity of soil bacterial beta

2.4 土壤细菌群落结构与土壤化学性质相关性分析

相关性分析结果(图6)表明，厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度与土壤速效钾、pH和有机碳呈显著正相关(P<0.05)，Myxococcota相对丰度与速效钾和pH呈显著正相关，Bacteroidota相对丰度与速效磷和有机碳呈显著负相关，Patescibacteria相对丰度与速效钾、速效磷和pH呈显著负相关，Desulfobacterota相对丰度与土壤速效钾、速效磷和pH呈极显著正相关关系，与有机碳呈显著正相关关系。结果表明，土壤化学性质大多与土壤细菌优势门类有显著相关关系。

AN:碱解氮 Alkali-hydro lyzed nitrogen; AK:速效钾 Available potassium; AP:速效磷 Arailable phosphorus; SOC:有机碳 Soil organic carbon.

2.5 施加生物炭对烟叶化学成分的影响

比较分析各个处理B2F等级烤后烟叶的化学成分，由表3可知，生物炭处理的烟叶总糖含量、还原糖含量、钾含量较对照处理均有显著增加，分别增加了16.4%、10.82%和11.78%；烟碱含量、总氮含量和蛋白质含量较常规处理相比有所增加，但差异未达显著水平。另外，烟叶中氯含量显著降低4.47%。结果表明，生物炭施用有利于改善烟叶质量，协调烟叶化学成分。

表3 生物炭施用对烤后烟化学成分的影响 Table 3 Effects of biochar on conventional chemical components of flue-cured tobacco g/kg

3 讨 论

3.1 生物炭对土壤养分的影响

添加生物炭可以改善土壤的养分状况，促进植物生长，提高作物产量[23]。本试验结果表明，与对照相比，施加生物炭显著提高了土壤的pH，这是由于生物炭在自然条件下呈碱性，pH值一般为7.0～10.5[24],施加到土壤中后可以增加土壤的pH，使烟株在适宜的pH条件下生长发育。氮素是影响植株生长发育的关键元素，直接决定了作物的产量。余其昌等[25]研究发现，生物炭与菜籽饼配施可以有效增加烤后烟叶的氮含量，其中以生物炭750 kg/hm2+菜籽饼1 500 kg/hm2处理效果最佳；Steiner等[26]研究发现，在土壤中施入生物炭可以显著提高水稻、高粱的产量；邓霞[27]在玉米、黄瓜地块中施加生物炭，显著提高了玉米和黄瓜的干质量。施加生物炭能有效提高土壤的持水能力，提升土壤氮的固持能力[28]，可以降低氮素的淋失作用[29]。

本研究发现，施加生物炭可以显著提高土壤速效磷含量，与刘卉等[30]试验结果一致，这可能是生物炭影响了土壤微生物的活性，促进了微生物对磷素的溶解和矿化效率，进而提高土壤中的速效磷含量[31-32]。本研究中施加生物炭显著提高了土壤速效钾和有机质含量，有机碳能够降低土壤的固钾能力，从而提高土壤中钾元素的有效性，施加生物炭可以提高土壤温度，加速土壤中缓效钾的释放，提升速效钾含量[33]。

3.2 生物炭对土壤细菌多样性及烟叶质量的影响

生物炭独特的多孔结构为土壤中的微生物提供了良好的环境，促进微生物的生长发育[34]。与常规施肥相比，施加生物炭肥改变了放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)、Myxococcota和Desulfobacterota等的相对丰度。说明生物炭显著影响了细菌群落结构。施加生物炭后，土壤酸杆菌门(Acidobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)丰度有明显的增加，这可能是因为生物炭的多孔性为细菌在土壤中生长及繁殖提供了更大的空间，从而增加了细菌的数量，同时还调节了土壤环境的物理和化学性质，影响土壤微生物生长、发育和代谢[35]。聚类树图和PCA分析结果表明，生物炭可以促使土壤微生物结构向特定的方向发展，这与任天宝等[36]的研究结果一致。相关性分析表明，土壤中优势细菌与土壤pH、速效钾、速效磷和有机碳均存在一定的相关关系，其中厚壁菌门(Firmicutes)、Myxococcota和Desulfobacterota与土壤pH、速效磷、速效钾和有机碳存在显著的正相关关系(P<0.05),Bacterdidota与Patescibacteria与土壤pH、速效钾、速效磷和有机碳存在显著的负相关关系。施加生物炭有利于成熟期土壤养分固持，并驱动根际促生细菌群落增加，进而改善烟株根际矿质营养和微生物群落结构，促进营养的吸收和烟株的生长发育及代谢，进而提高烟叶产量，这与冯慧琳等[10]生物炭对烤烟根际细菌群落的影响及其作用机制研究结果相一致。

综上，生物炭可以改善土壤的化学性质，显著提高土壤pH、速效磷、速效钾和有机碳含量。生物炭对土壤养分的改变，促进了土壤细菌群落的变化，提高了功能微生物如土壤酸杆菌门(Acidobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)的丰度。本研究结果表明，pH是影响细菌群落结构的关键因子之一。土壤微生态环境在作物的生长发育中起着重要的作用，施加生物炭对有利于改善烤烟成熟期土壤养分和根际细菌群落结构。