种植密度和施氮量互作对盐碱地紫花苜蓿生长性能和生理特性的影响

卢发光，顾立峰，刘昱茜，任 桢，施 雨，徐振然，周桂生，卢海潼，王小山，张网定，任志强，朱广龙

（1.扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009；2.江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心，江苏扬州 225009；3.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；4.扬州市气象局，江苏扬州 225009；5.山西省吕梁市临县畜牧技术推广站，山西吕梁 033200）

土地盐碱化严重威胁作物正常生长，限制农业生产，已经成为全球范围内共同面临的困难[1-2]。中国是盐碱地大国，盐碱荒地和影响耕种的盐碱地总面积超过3.33×107hm2，其中具有农业发展潜力的占中国耕地总面积的10%以上[3]。盐土种植业是农业综合生态开发的主要部分，具有不可替代性[4-5]。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是当今世界栽培最广泛的牧草之一，因具有干草产量高、草地持久性强、耐旱、耐寒性强、易成活等特点，适合在盐碱地种植，在修复土壤环境中也有重要潜力，并且多年种植对盐碱地改良具有明显效果[6-7]。施肥是提高紫花苜蓿抗性、确保其资源可持续利用的有效方法，但过量施用则会影响其对其他营养的吸收，并且造成肥料浪费和环境污染[8]。因此，合理施肥是调节生态系统养分平衡、维持和提高土壤肥力的重要措施之一。本研究以紫花苜蓿WL919为材料，在江苏沿海滩涂盐碱地设置密度和施氮量两个试验因子，研究不同种植密度以及施氮量对盐碱地紫花苜蓿产量、生理特性等的影响，以期为沿海盐碱地苜蓿高产栽培提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2019−2020年在江苏省盐城市大丰区大丰沿海林场(33°20′N，120°47′E)盐碱地进行。该地区属亚热带与暖湿带的过渡地带，四季分明，气温适中，常年平均气温14.1℃，雨量充沛，常年降水总量1042.2 mm，适宜喜湿作物的生长，无霜期213 d，年日照2 238.9 h。试验地土壤pH 8.4，有机质含量19.75 g·kg−1，全氮含量0.72 g·kg−1，速效磷含量1.45 mg·g−1，速效钾含量279 mg·g−1，盐分(主要包括氯化盐、碳酸盐)平均含量为1.68 g·kg−1。

1.2 试验材料与试验设计

试验材料为紫花苜蓿WL919，设置3个播种量15.0(D1)、30.0(D2)和45.0 kg·hm−2(D3)，3个施氮量150.0(N1)、225.0(N2)和300.0 kg·hm−2(N3)，播种方式为撒播，覆土深2～4 cm。采用种植密度和施氮量2个因素随机区组试验设计，3次重复，小区面积为30 m2。氮肥按5꞉5分别作基肥和返青肥施入。此外，每个处理施磷肥225 kg·hm–2，在播种前作基肥施入，2019年11月5日播种。

1.3 取样与测定

在紫花苜蓿全年生育期共取样4次，分别于播种后60 d(苗期)、90 d(分枝期)、120 d(现蕾期与初花期)、150 d(成熟期)，每个小区取0.5 m2内的全部植株，称取鲜重，测量株高，烘干称量干重，每个小区另取5株苜蓿顶部叶片，用于测定生理指标。

1.4 指标测定及方法

株高：每个小区测量10株紫花苜蓿植株的自然高度，求平均值。

鲜重：每个小区取样0.5 m2苜蓿后立即称量鲜重，然后换算成每公顷的产量。

干重：将取回的鲜样置于105℃烘箱内，杀青30 min 后再置于75℃烘箱内烘至恒重，称重。

生理指标：另取10 株植株上部同一部位的叶片，叶绿素含量采用乙醇– 丙酮混合提取法[9]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法[10]，脯氨酸含量采用茚三酮法[11]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用四氮唑蓝(NBT)还原法[12]，过氧化氢酶(CAT)活性用紫外线吸收法[13]，过氧化物酶(POD)活性用愈创木酚法[14]。

1.5 数据分析

采用Excel 2019进行数据整理和作图，用Statistix 9对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 种植密度和施肥对苜蓿生长和产量的影响

2.1.1 对株高的影响

在各生长时期施氮量显著影响苜蓿的株高(P<0.05) (表1)，而种植密度、密度与氮肥的互作效应仅在播种后120和150 d 对株高有显著影响(P< 0.05)。种植密度相同时，低密度(D1)下，播种后60、90和120 d的株高随着施氮量的增加而增加；中等密度(D2)下，整个生育期的株高随着施氮量的增加先增后减；高密度(D3)下，播种后120和150 d 时，株高随着施氮量的增加呈现先增后减趋势。施氮量相同时，低氮(N1)下，播种后90 d 时株高随着种植密度的增加而增加；中氮(N2)下，播种后90、120和150 d的株高随着种植密度的增加呈先增后减趋势；高氮(N3)下，播种后90、120和150 d 的株高随着种植密度的增加而减少。种植密度和施氮量互作条件下，播种后150 d 时D2N1和D2N2处理下的株高较高，与D1N1处理相比株高分别增加了18.23%和27.15%。在整个生育时期，D2N2互作条件下的株高均高于其他的密度和施肥互作处理(表1)。

表1 不同种植密度和施氮量下紫花苜蓿不同时期的株高Table 1 Alfalfa plant heights at the different planting densities and nitrogen rates cm

2.1.2 对苜蓿干草产量的影响

种植密度和施氮量对各时期干草产量的影响均达极显著水平(P< 0.01) (表2)，两者互作在播种后120和150 d 对干草产量影响显著(P<0.05)。密度不变的条件下，整个生育期的干草产量在低密度条件下随着施氮量的增加而增加；中等密度下，所有时期的干草产量都随着施氮量的增加先增后减；高密度下，除播种60 d 外，其余时期的干草产量都随着施氮量的增加而增加。施氮量相同时，低氮下，播种后90和150 d 时，干草产量随着种植密度的增加而增加；中氮下，整个时期的干草产量随着种植密度的增加呈先增后减趋势；高氮条件下，播种后90、120和150 d 时，干草产量则随着种植密度的增加而增加。种植密度和施氮量互作条件下，播种后150 d时，D2N2、D3N3处理下干草产量较大，与D1N1处理相比干草产量分别增加了133.2%和84.9%。

表2 不同种植密度和施氮量下紫花苜蓿不同时期的干草产量Table 2 Alfalfa dry biomass yield at the different planting densities and nitrogen rates kg·hm–2

苜蓿的干草产量随着生育期的生长而增加，在播种后150 d 达到最大值。但此时紫花苜蓿叶片开始减小，含水量降低，营养品质以及各项生理特性均有所下降，对紫花苜蓿的饲草品质有很大的影响。因此，若将紫花苜蓿作为干草饲料收获，最适宜的时期是在播种后的120 d 左右，此时紫花苜蓿正处于现蕾期和初花期，也是最适合收获的时期。

2.2 种植密度和施肥对苜蓿生理生化特性的影响

2.2.1 对丙二醛含量的影响

播种后60 d 时，苜蓿MDA 含量相对较低，播种后90 d 时，含量最高(图1)。种植密度相同时，低密度下，播种后60和90 d 时，MDA 的含量受施氮量影响较小；播种120 d、中高密度下，MDA 含量随着施氮量的增加呈先减后增的趋势。当施氮量相同时，低氮条件下，播种后60和90 d 时，MDA 含量随着密度的增加而减少；高氮条件下，播种120 d 时，MDA 含量随着种植密度的增加而增加。两者互作条件下，播种90 d MDA 含量最高，在D1N3处理下达到最大，播种后120 d 时，在D3N1处理下MDA 含量达到最大，最小值出现在D3N2组合。

图1 不同种植密度和施氮量下丙二醛的含量Figure 1 Malondialdehyde (MDA)content at the different planting densitiesand nitrogen rates

2.2.2 对脯氨酸含量的影响

随着生育期的推进，紫花苜蓿叶片中脯氨酸含量逐渐增加，在播种后120 d 时的D2N2组合下达到最大，为932.3μg·g−1(图2)。种植密度相同时，低密度下，播种后90和120 d 时，苜蓿叶片脯氨酸含量随施氮量增加先减后增；中等密度时，整个时期脯氨酸的含量随施氮量增加而先增后减，最大值均出现在D2N2组合；高密度下，播种后90和120 d 时，苜蓿叶片脯氨酸含量也随着施氮量增加呈现先减后增的趋势。施氮量相同条件下，低氮(N1)播种后120 d 时脯氨酸含量随着密度增加而增加；中氮(N2)条件下，整个生育期脯氨酸含量随着密度增加先增大后减小；高氮(N3)条件下，在播种后60和90 d时，叶片内脯氨酸含量也随着密度增加而先增后减。在种植密度和施氮量互作条件下，播种后60 d，叶片内脯氨酸含量差异不显著(P>0.05)，播种后90和120 d，D2N2处理的脯氨酸含量明显高于其他处理。在播种后120 d 时，D2N2和D3N3处理下脯氨酸含量较高，与D1N1处理相比脯氨酸含量分别增加了24.3%和21.6%。

图2 不同种植密度和施氮量下脯氨酸的含量Figure2 Prolinecontent at thedifferent planting densitiesand nitrogen rates

2.2.3 对超氧化物歧化酶活性的影响

随着生长时间的推移，紫花苜蓿叶片内SOD活性逐渐降低，播后60 d 时D2N2组合下达到最高值1650.5 U·g−1(图3)。种植密度相同时，低密度下施氮量对SOD活性的影响不明显；中密度下，SOD活性随施氮量增加呈先增后减；高密度下，播种后90和120 d时，SOD活性随着施氮量的增加先减少后增加。施氮量相同时，SOD活性随着密度增加而先增后减。

图3 不同种植密度和施氮量下超氧化物歧化酶的活性Figure 3 Superoxide dismutase (SOD)activity at the different planting densities and nitrogen rates

2.2.4 对过氧化物酶活性的影响

随着生长时间的推移，紫花苜蓿叶片内POD活性先增加后减少，播后90 d 时D3N3处理下的POD活性达到最高，为324.7 U·(g·min)–1。低密度和高密度处理下，播后60和90 d 时，POD活性随着施氮量增加而增加。中密度下，POD活性随着施氮量增加呈先增后减趋势。施氮量相同时，中氮处理下，紫花苜蓿叶片POD活性随着密度增加先增后减。整个生育期在种植密度和施氮量互作条件下，高密度和高施氮量(D3N3)处理下的POD活性均高于其他处理。播后120 d，D1N2和D2N2处理下POD活性最高，与D1N1处理相比分别增加了43.7%和53.9%(图4)。

图4 不同种植密度和施氮量下过氧化物酶的活性Figure 4 Peroxidase dismutase (POD)activity at the different planting densities and nitrogen rates

2.2.5 对过氧化氢酶活性的影响

随着生长时间的推移，苜蓿CAT 活性的变化趋势是播种后90 d > 播种后60 d > 播种后120 d (图5)。低密度下，播后90 d 时，CAT 活性随着施氮量增加而增加；中高密度下，CAT 活性随着施氮量增加先增后减。施氮量相同时，中氮和高氮下，播种后60和90 d 时，CAT活性随着密度增加先增后减；播种后120 d 时，密度对CAT 的活性几乎没有影响。种植密度和施氮量互作条件下，3个时期CAT 活性均在中密度下最大，播后60 d 时，D2N2处理下CAT 活性较D1N1处理增加了124.7%；播后90 d 时，D2N2处理下CAT活性较D1N1处理增加了62.8%；播后120 d 时，D2N2处理下CAT活性较D1N1处理增加了82.1%。

图5 不同种植密度和施氮量下过氧化氢酶的活性Figure 5 Catalase (CAT)activity at the different planting densities and nitrogen rates

3 讨论与结论

3.1 种植密度和施氮量对紫花苜蓿生长和产量的影响

种植密度是影响作物生长发育和产量形成的关键因素[15]。密度过小时，虽然单株所获得的土壤养分增加，光合面积和时间也增加，但由于单位面积群体小，导致产量较低[16]。密度过大时，单株所吸收的养分减少，受到的光照也减少，同样不利于产量的提高[17]。本研究结果表明，紫花苜蓿的株高在中低氮下随着密度的增加呈先增后减趋势，在中密度(D2)下最高，说明中密度(D2)最利于试验地紫花苜蓿株高的增加。高氮(N3)水平下，株高则随着密度的增加而减少，说明施氮量和种植密度互作时，高氮水平下种植密度越高，紫花苜蓿株高越小。干草产量随着密度的增加先增加后减少，因此，中密度(D2)有利于盐碱地紫花苜蓿产量的提高，种植密度过高或过低都不利于盐碱地紫花苜蓿产量的提高，这与孟凯等[18]的研究结果相同。

氮是植物体内许多重要有机化合物的组成成分，蛋白质、核酸、叶绿素、酶、维生素、生物碱和一些激素都含有氮元素[19]。植物体内的各项生命活动，如光合作用、细胞增长分裂和遗传变异等均有氮的参与。因此，氮对植物的生命活动、产量的形成与品质的优劣有着极为重要的作用。有研究表明，施氮后，紫花苜蓿的株高、单株分枝数和干重均显著增加[20]，但是施氮量过高不利于紫花苜蓿粗蛋白含量的增加，也不利于粗纤维含量的降低[21]。本研究发现，增加施氮量有利于碱地紫花苜蓿的株高和干草产量的增加。种植密度和氮肥互作条件下，中等度(D2)水平下，施氮量过高又不利于盐碱地紫花苜蓿的产量的提高。

紫花苜蓿的最佳收获时期是现蕾期至初花期，综合种植密度和施氮量互作对株高、干草产量以及饲草品质的影响，结合前人研究，对于江苏沿海盐碱地来说，中等密度和中等施氮量互作条件下，播种后120 d左右割刈，此时苜蓿的粗蛋白含量较其他时期高，粗纤维和木质素等含量较其他时期含量低，相对饲草价值较高，同时也是紫花苜蓿的最佳收获时期，最适合作为饲草收割，此时干草产量最高产量可以达到11 057.2 kg hm–2[22-23]。

3.2 种植密度和施氮量对紫花苜蓿生理特性的影响

MDA 是膜脂过氧化最重要的产物之一，会导致膜损伤的加剧，MDA 含量可以表征膜脂过氧化的程度和膜系统的受损程度，因此是植物衰老生理和抗逆性生理研究中的常用指标[24-25]。本研究结果表明，高密度种植不利于MDA 含量的降低，降低密度可以降低MDA 含量。播种后90和120 d 时，低氮(N1)条件下MDA 含量最大，说明增施氮肥可以降低MDA 含量。

脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质，脯氨酸除了作为植物细胞质内渗透调节物质外，还在稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面起重要作用。植物体内的脯氨酸含量越高，则代表植物的抗逆性越强。本研究结果表明，脯氨酸含量随着种植密度的增加先增后减，说明中密度(D2)可以提高植物叶片内脯氨酸的含量，高密度(D3)则会导致叶片内脯氨酸含量的降低。氮肥对苜蓿叶片内脯氨酸含量的影响各有不同，但整体来看，增施氮肥能提高叶片内脯氨酸的含量。在种植密度和施氮量互作条件下，播后60 d 叶片内脯氨酸含量没有明显区别，播后120和150 d，D2N2处理下，叶片内脯氨酸的含量要明显高于其他处理，说明种植密度和施氮量互作条件下，中密度下施氮有利于提高盐碱地紫花苜蓿的抗逆性。

活性氧(ROS)的形成是氧正常代谢的天然副产物，并且在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用，一般来说，植物体内的活性氧可以自我清除，不会危害到植物本身[26]。然而在环境压力下(如干旱，盐度和寒冷等)，ROS水平会急剧增加并对细胞结构造成严重危害。抗氧化酶SOD、CAT、POD等可以清除过多的ROS，以维持细胞膜的稳定性和功能性[27]。不同种植密度下，冬小麦(Triticum aestivum)开花后旗叶SOD和POD活性都随密度的增加而下降[28]。玉米(Zea mays)生育后期稳位叶POD、CAT和SOD的活性随着施氮量的增加逐渐增加，MDA含量则随着施氮量的增加而减少[29]。本研究发现，种植密度对CAT活性的影响不明显，SOD活性随着种植密度的增加先增后减。POD活性随着密度增加先增后减，在中等密度下(D2)活性较高。中等(N2)和高施氮量(N3)均能显著的提高了SOD、CAT和POD的活性，说明了适当增加种植密度或者增加氮肥量可以清除由于盐分胁迫紫花苜蓿体内的过量ROS，提高盐碱地紫花苜蓿的抗逆性，缓解盐分对紫花苜蓿的胁迫。