刺梨多酚对急性酒精中毒大鼠的解酒和护肝作用

周宏炫，黄 颖，谭书明*，涂永丽，罗继伟

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州 贵阳 550025）

急性酒精中毒（acute alcoholism，AAH）又称醉酒，是由于一次过量饮酒导致血液中乙醇浓度过高，从而引起头晕、恶心呕吐、昏迷等症状，并伴随着肝脏、心脑血管等多系统损伤的现象，严重危害消费者身体健康[1]。近年来，随着人们生活水平的提高和饮酒习惯的改变，AAH的发病率越来越高，并成为除心脑血管及肿瘤外的世界第三大公共卫生问题[2]。肝脏是乙醇代谢的主要器官，AAH最常见的症状就是酒精性肝病[3]。研究表明，乙醇造成肝损伤的主要机制是氧化应激和脂质过氧化反应，表现为乙醇可以降低机体抗氧化能力，诱导肝脏发生脂质过氧化进而损伤肝细胞[4]。近期植物多酚缓解酒精性肝损伤机制的研究众多，如蜂蜜多酚、茶多酚、石榴叶多酚、葡萄多酚、苹果多酚等均被证明有较好的护肝作用，其作用机理包括激活机体的抗氧化系统、抑制脂质过氧化和调节信号通路，从而改善肝损伤[5]。

刺梨（Rosa roxburghiiTratt.）属蔷薇科多年生落叶小灌木，广泛分布于中国西南地区[6]，具有抗炎[7]、抗氧化[8]、抗癌[9]和抗动脉粥样硬化[10]等作用。刺梨富含多种生物活性成分，如VC、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、多酚和多糖等，因此被誉为“中国三大新兴水果之一”[11]。刺梨中多酚类物质含量丰富，具有多元酚结构，主要由没食子酸、儿茶素、鞣花酸、绿原酸、阿魏酸、表儿茶素等成分复合而成，是极具开发利用价值的优质资源[12]。目前相关人员对刺梨多酚（Rosa roxburghiiTratt.polyphenols，RRTP）的功能研究多集中在美白[13]、抗氧化[14]方面，而有关其对AAH的解酒和护肝作用研究鲜见报道。

本研究采用一次灌胃过量白酒的方式建立大鼠AAH模型，通过测定血液乙醇质量浓度和肝脏乙醇代谢酶活力考察RRTP的解酒作用；通过生化指标测定、病理学检查以及实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测，进一步研究RRTP对AAH大鼠肝脏的保护作用，并从肝脏组织氧化损伤角度探讨其作用机制，以期为RRTP保健食品的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性SD大鼠由长沙市天勤生物技术有限公司提供，体质量为180～200 g，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0014。

刺梨 贵州宏财聚农投资集团有限责任公司；白酒（乙醇体积分数56%） 北京红星股份有限公司；海王金樽（主要成分为牡蛎提取物） 深圳市海王健康科技发展有限公司。

AB-8大孔树脂 天津波鸿树脂科技有限公司；乙醇、乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）ELISA试剂盒 上海桥杜生物科技有限公司；谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、SOD试剂盒 南京建成生物工程研究所；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色液 赛维尔生物科技有限公司；cDNA合成试剂盒、TRIzol试剂盒 美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 仪器与设备

SG8200HPT超声波清洗仪 上海冠特超声仪器有限公司；CTFD-12S真空冷冻干燥机 青岛永合创信电子科技有限公司；Stepone plus型荧光定量PCR仪 美国ABI公司；SpectraMax190连续波长多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；H1-16KR高速冷冻离心机湖南可成仪器设备有限公司；DY89-II电动玻璃匀浆机宁波新芝生物科技股份有限公司；BMJ-III型包埋机常州郊区中威电子仪器厂；Motic BA400生物显微镜麦克奥迪实业集团有限公司；MODEL SPX-150B-Z型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 RRTP的制备

称取20 g切碎的新鲜刺梨果，以料液比1∶10加入60%（体积分数，后同）的乙醇溶液，于50 ℃、350 W条件下超声提取60 min后抽滤，收集滤液，于45 ℃条件下旋蒸去除乙醇。参考文献[15]提取RRTP，得到冻干的RRTP。采用Folin-Ciocalteu法[16]测得RRTP样品中多酚质量分数为65.41%。

1.3.2 动物分组与建模

60 只雄性大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组以及RRTP低、中、高剂量组，每组10 只。实验室温度（22±2）℃、相对湿度（55±5）%，12 h光暗循环，自由饮水、饮食。适应性喂养1 周后，每日给正常组和模型组大鼠灌胃生理盐水，阳性对照组每日灌胃100 mg/kgmb的海王金樽，RRTP低、中、高剂量组分别每日灌胃50、100、200 mg/kgmb的RRTP，灌胃量均为10 mL/kgmb，连续30 d。于末次给药30 min后，除正常组给予生理盐水外，其他5 组均灌胃白酒（乙醇体积分数56%）。根据本实验室前期研究[17]，选择白酒灌胃剂量15 mL/kgmb进行灌胃，建立AAH模型。

1.3.3 血清指标测定

分别于灌酒后30、60、90、120 min剪尾取血，止血后放回笼中，血液于4 ℃、3 000 r/min离心15 min得到上清液即血清，用于后续相关指标的测定。使用试剂盒测定血液中的乙醇质量浓度。然后于灌酒后12 h摘眼球取血，收集的血液于4 ℃、3 000 r/min离心15 min得到上清液，使用相应试剂盒检测血清中ALT、AST和TG水平。

1.3.4 肝脏指标测定

摘除眼球采血完成后，颈椎脱臼处死大鼠，快速取出肝脏，用预冷生理盐水漂洗并用滤纸吸干。剪取少量肝组织，加入9 倍体积的生理盐水，采用电动玻璃匀浆机于冰上匀浆，在4 ℃条件下，以2 500 r/min离心10 min，得到上清液。按照试剂盒说明书的方法测定肝脏组织中ADH、ALDH、SOD、GSH-Px、CAT活力以及MDA、GSH含量。

1.3.5 肝脏切片观察

参照Song Haizhao等[18]的方法，将肝脏组织样品浸泡在体积分数10%的福尔马林溶液中固定，经脱水、包埋、切片及HE染色处理后，使用光学显微镜观察各组大鼠肝脏形态学改变。

1.3.6 实时荧光定量聚合酶链式反应

按照TRIzol试剂盒说明书，液氮研磨肝脏组织后转入离心管，加入TRIzol提取剂处理组织，5 min后加入氯仿，以12 000 r/min离心5 min，取上清液经酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀后室温晾干得到大鼠肝组织总RNA，将mRNA经逆转录合成cDNA，进行定量PCR检测核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）、血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的mRNA相对表达水平。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸34 s，40 个循环。使用2-ΔΔCt法计算基因的mRNA相对表达，以β-actin作为内参基因。引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Sequences of primers used for amplification of target genes

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 RRTP对AAH大鼠血液乙醇质量浓度的影响

一次过量摄入乙醇会引起血液中乙醇质量浓度的急剧升高，如表2所示，与正常组相比，模型组大鼠血液乙醇质量浓度显著上升（P＜0.05），并于灌酒后30 min达到最高值316.95 mg/dL，而后缓慢下降，到120 min时仍具有较高水平，说明AAH模型建立成功；与模型组相比，RRTP低剂量组在灌酒后60、90 min时可显著降低血液中的乙醇质量浓度（P＜0.05），而中、高剂量组在灌酒后30、60、90、120 min时均可显著降低血液乙醇质量浓度（P＜0.05）。结果表明，RRTP对AAH大鼠具有一定的解酒作用，且存在一定的剂量-效应关系。

表2 RRTP对大鼠血液乙醇质量浓度的影响（n ＝10）Table 2 Effect of RRTP on blood alcohol concentration in rats with acute alcoholism (n = 10)mg/dL

2.2 RRTP对AAH大鼠乙醇代谢酶的影响

ADH和ALDH是乙醇代谢的关键酶，其活力的变化会直接影响血液中的乙醇浓度[19]。如表3所示，与正常组相比，模型组肝脏中ADH和ALDH活力显著升高（P＜0.05），表明饮酒会增强大鼠体内乙醇代谢酶活力。与模型组相比，阳性对照组及RRTP低、中、高剂量组均能显著增强AAH大鼠肝脏ADH活力（P＜0.05）；中、高剂量RRTP组中ALDH活力显著增强（P＜0.05），但低剂量RRTP组ALDH活力无显著性差异（P＞0.05）。结果表明RRTP可以通过增强ADH和ALDH活力加快乙醇代谢，从而降低血液中的乙醇水平。

表3 RRTP对大鼠肝脏ADH和ALDH活力的影响（n＝10）Table 3 Effect of RRTP on ADH and ALDH activities in liver of rats (n = 10)

2.3 RRTP对AAH大鼠肝损伤的影响

血清ALT、AST和TG水平是评价急性肝损伤的重要指标，过量饮酒会导致肝脏受损，引起血清ALT、AST和TG水平显著升高[20]。如表4所示，与正常组相比，模型组大鼠血清中ALT、AST和TG水平显著上升（P＜0.05），表明AAH会诱导肝脏发生损伤，提示急性酒精性肝损伤模型建立成功；与模型组相比，阳性对照组和RRTP各剂量组均能显著降低大鼠血清中ALT、AST和TG水平（P＜0.05），表明RRTP对肝脏具有一定的保护作用。

表4 RRTP对大鼠血清中ALT、AST和TG水平的影响（n ＝10）Table 4 Effect of RRTP on serum ALT, AST and TG levels in rats (n = 10)

2.4 RRTP对AAH大鼠氧化应激的影响

低水平SOD、GSH-Px、CAT、GSH和高水平MDA是肝脏发生氧化应激的重要标志[21]。如表5所示，与正常组相比，模型组大鼠肝脏SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量均显著降低，MDA水平显著升高（P＜0.05），表明乙醇致肝损伤大鼠肝脏抗氧化能力降低，氧化应激增强。与模型组相比，RRTP各剂量组均能显著增加大鼠肝脏SOD、GSH-Px活力，显著降低MDA水平（P＜0.05）；其次，RRTP也能明显增加CAT和GSH水平，尽管仅在RRTP高剂量组中观察到统计学差异（P＜0.05）。结果说明RRTP能改善肝脏的氧化应激状态，且存在一定的剂量-效应关系。

表5 RRTP对大鼠肝脏SOD、CAT、GSH-Px活力和GSH、MDA水平的影响（n＝10）Table 5 Effect of RRTP on SOD, CAT and GSH-Px activities, and GSH and MDA levels in liver of rats (n = 10)

2.5 RRTP对Nrf2、HO-1 mRNA相对表达水平的影响

图1A、B分别显示了Nrf2、HO-1在AAH大鼠肝脏中的表达情况。与正常组比较，模型组大鼠肝组织中Nrf2、HO-1mRNA相对表达水平显著降低（P＜0.05），表明乙醇可以抑制Nrf2/抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）信号通路。与模型组比较，阳性对照组大鼠肝组织Nrf2、HO-1mRNA的表达量显著提升（P＜0.05），不同的RRTP剂量组HO-1mRNA相对表达水平均显著提升（P＜0.05），Nrf2mRNA相对表达水平只有中、高剂量组显著升高（P＜0.05），说明RRTP可以剂量依赖的激活Nrf2/ARE通路，提高机体抗氧化体系能力。

图1 RRTP对大鼠肝组织中Nrf2（A）和HO-1（B）mRNA相对表达水平的影响Fig.1 Effect of RRTP on mRNA expression of Nrf2 (A) and HO-1 (B)in liver of rats

2.6 RRTP对AAH大鼠肝脏的组织病理学影响

由图2肝脏HE染色结果可知，正常组大鼠肝细胞形态结构完整，肝索排列规则，在中央静脉呈放射状排列，胞浆内无脂滴，肝窦未见明显淤血扩张及炎性浸润。模型组大鼠肝细胞肿胀，出现局部坏死，肝索排列紊乱，胞质中出现大小不一的脂滴，并伴有少量炎性细胞浸润。与模型组相比，阳性对照组及3 个RRTP剂量组肝细胞损伤程度明显减轻，阳性对照组肝索排列整齐，肝窦无扩张，少量肝细胞出现轻微的变性和坏死；RRTP低剂量组有少量肝细胞发生变性坏死，胞浆内有部分脂滴出现；RRTP中、高剂量组肝细胞结构较完整，肝索形状排列比较清晰，胞浆内无脂滴出现，脂肪变性程度轻于低剂量组。

图2 大鼠肝脏组织病理学变化Fig.2 Histological observations of liver tissues

3 讨 论

AAH是由过量饮酒引起的，对全球发病率和死亡率有重要影响[22]。研究表明，摄入的乙醇经胃肠道吸收后迅速分散到血液中，引起血液乙醇含量的上升，之后被输送到肝脏中进行代谢而清除[23]。ADH和ALDH是体内参与乙醇代谢的关键酶，主要存在于肝细胞的细胞质和线粒体中。乙醇经ADH氧化成乙醛，再通过ALDH氧化为乙酸，乙酸进一步代谢成H2O和CO2排出体外，从而显著降低血液中的乙醇含量[24]。本研究结果显示，AAH大鼠血液中的乙醇质量浓度急剧上升，肝脏ADH和ALDH活力增加；相比于模型组，RRTP预处理显著降低血液乙醇水平（P＜0.05），且ADH和ALDH活力进一步增强。说明RRTP能通过提高ADH和ALDH活力加快乙醇代谢，降低血液乙醇质量浓度，具有一定的解酒作用。该结果与Kaviarasan等[25]对葫芦巴多酚解酒机理的研究结果相同。

ALT和AST是存在于肝细胞浆和线粒体的两种主要转氨酶。正常情况下，ALT和AST在血清中的含量很少，但当肝脏受到损伤时，肝细胞膜通透性增加，ALT和AST就会渗透至血液中，所以血清中的ALT和AST水平可反映肝脏的健康状况[26]；TG水平升高是肝细胞发生脂肪变性的早期表现；临床上通常将ALT、AST和TG水平作为反映肝损伤程度的血清学指标[27]。本研究发现，模型组大鼠血清ALT、AST和TG水平显著升高，病理组织切片也显示肝细胞形态结构发生破坏，胞浆内有大量脂滴出现；而RRTP组肝细胞结构相对完整，脂肪变性程度减轻，且ALT、AST和TG水平均降低，表明AAH会引起大鼠肝细胞变性或坏死，补充RRTP能显著减轻乙醇引起的肝损伤。与邢佳等[28]研究的石榴叶多酚能够降低血清ALT、AST和TG水平，对急性酒精性肝损伤具有保护作用的结论一致。

大量研究表明，乙醇造成的肝损伤与氧化应激和脂质过氧化反应密切相关。乙醇在体内代谢主要依赖于肝脏，摄入过量乙醇会超过肝脏的代谢能力，促进大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生，这些ROS会破坏机体内部氧化-抗氧化系统的动态平衡，导致氧化系统失衡[29]，而在体内过度累积会引发脂质过氧化进而损伤肝细胞。因此，AAH易导致酒精性肝损伤。在内源性抗氧化系统中，SOD/GSH-Px/CAT是最主要的一组抗氧化酶，它们共同抵御机体受到的氧化应激损伤。SOD主要将ROS转化为过氧化氢，然后经GSH-Px和CAT将过氧化氢进一步分解成水[30]。此外，GSH也是抵抗氧化应激的重要防御线，可直接清除体内的ROS[31]。这些抗氧化剂均能保护肝脏免受氧化应激的损害，但很容易被脂质过氧化物清除。MDA是脂质过氧化的主要产物，其不仅会干扰抗氧化防御，还会引起肝细胞的变性和坏死，使血液中ALT、AST和TG水平升高[32]。在本研究中，模型组大鼠肝脏SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量显著下降（P＜0.05），MDA含量显著升高（P＜0.05），表明AAH后机体的抗氧化应激能力降低，导致脂质过氧化物的积累从而引起肝细胞损伤。而预处理RRTP能够明显增加肝脏SOD、GSH-Px、CAT活力和GSH含量，降低MDA含量，表明RRTP可通过增强机体抗氧化能力，抑制脂质过氧化反应来改善急性酒精引起的肝损伤，与相关文献报道结果[33]一致。

Nrf2/ARE通路作为抵抗内外界氧化的防御性信号通路，在维持机体的抗氧化体系中占有重要的地位[34]。Nrf2是调节机体抗氧化应激的重要转录因子，能进入细胞核与ARE结合形成Nrf2/ARE通路，调控下游抗氧化基因的转录。HO-1是Nrf2/ARE通路调节的主要抗氧化防御基因，具有清除自由基、保护细胞的作用[35]。因此，Nrf2/ARE抗氧化信号通路可能会成为治疗酒精性肝损伤的有效靶点[36]。Shu Guangwen等[37]研究发现，乙醇暴露会下调Nrf2、HO-1表达量，本实验显示急性乙醇摄入会显著降低肝组织Nrf2及其下游的HO-1mRNA相对表达水平，而RRTP能够剂量依赖地提高Nrf2和HO-1mRNA相对表达水平，说明RRTP可能通过调控Nrf2/ARE通路提高机体抗氧化防御能力，发挥对急性酒精性肝损伤的保护作用。

4 结 论

RRTP具有良好的解酒和护肝作用，可改善因乙醇引起的醉酒和肝损伤，其解酒机制可能与增强乙醇代谢酶活力有关；能够通过抑制氧化应激和脂质过氧化而改善肝损伤，其抗氧化应激作用机制可能与上调肝组织Nrf2/ARE信号通路中Nrf2表达和激活其下游抗氧化酶HO-1相关。因此，RRTP可作为功能保健食品缓解因乙醇引起的AAH，其能否改善晚期酒精性肝损伤如纤维化、肝硬化等仍有待研究。