花生主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的预测及鉴定

王俊娟，李欣芮，陈 成，孙善峰，刘桂蓉，车会莲*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，食品质量与安全北京实验室，北京 100083）

花生过敏是最严重的食物过敏之一。食用花生而引发的过敏因其潜在的普遍性、危险性、长期性以及不断增加的发病率而日益受到重视[1-2]。到目前为止，已有16 种花生过敏原蛋白被国际免疫学会联合会、变应原命名小组委员会报道并注册[3]。过敏原分为主要食物过敏原和次要食物过敏原，对超过50%患者血清的免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）具有反应性的过敏原为主要食物过敏原，而低于50%则被视为次要食物过敏原。花生过敏原Ara h 1被认为是花生的主要过敏原，也是花生蛋白的主要组成部分[4-5]。

Ara h 1是豌豆球蛋白家族蛋白中的7S球蛋白，分子质量范围为63～65 kDa。Ara h 1结构是由3 个具有类似于其他7S球蛋白结构特征的相同单体组成的三聚体，其核心氨基酸序列与其他7S球蛋白非常相似，热降解温度为88.3 ℃，略高于其他7S球蛋白的平均值（87.5 ℃）[6-8]。该序列与大豆β-球蛋白（PDB:1UIK）和小豆蛋白（PDB:2EA7）具有53%的同源性，属于Cupin超家族[9-10]。Ara h 1具有热稳定性和消化稳定性，并且大多数Ara h 1表位以其固有结构暴露在蛋白质表面[11-12]。

抗原表位又称抗原决定簇，是指抗原分子表面具有特殊结构和免疫活性的氨基酸序列，且具有能刺激机体产生免疫反应的免疫活性区。根据与抗原结合的受体细胞不同，可将抗原表位分为T细胞抗原表位和B细胞抗原表位。T细胞抗原表位仅能识别由抗原提呈细胞加工后表达于细胞表面的肽段-主要组织相容性复合物，检测方法较为复杂，相关研究多停留在预测阶段[13]。B细胞表位是被抗体可变区识别的抗原的一小部分。抗体互补位通过非共价力与其对应的抗原表位相互作用。这种相互作用是高度特异性的，并且是肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面上IgE的变应原交联以及随后的细胞脱颗粒的分子基础。B细胞表位包括连续氨基酸组成的线性表位和三维基序组成的构象表位[14]。过敏原在致敏过程中，其线性B细胞表位发挥了至关重要的作用，但目前对于Ara h 1线性细胞表位的鉴定仍停留在检测覆盖过敏原氨基酸全序列的肽段与过敏患者血清IgE的结合强度上，工作量巨大。较准确的方法是，获得Ara h 1特异性抗体，利用噬菌体展示技术筛选获得结合表位肽段，但目前Ara h 1特异性抗体较难获得[15-16]。另外，过敏原在经口摄入后，要经过胃和肠道的消化才会被小肠吸收。因此，过敏原或其主要线性B细胞表位必须具有抵抗胃肠道消化酶的性质，在经过胃肠道后能保留其相对完整或具有免疫活性能力结构[17]。据此，本研究先采用生物信息学分析花生主要过敏原Cupin超家族Ara h 1线性B细胞表位的氨基酸组成，及其与Ara h 1二级、三级结构之间关系，总结归纳线性表位存在的规律。从天然花生中提取粗蛋白，经体外模拟胃肠道消化后，利用高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技术检测过敏原Ara h 1保留的抗消化肽段。通过比较测定得到的抗消化肽段与预测得到的线性B细胞表位序列片段来预测更精确的Ara h 1线性B细胞表位。本研究建立的体外模拟胃肠道消化结合生物信息学鉴定Cupin超家族过敏原线性B细胞表位的方法可为低致敏性蛋白的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生（中粒，‘冀花4号’）购自北京市美廉美超市。

BCA蛋白定量试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；蛋白上样缓冲液 北京百瑞极生物科技有限公司；标准蛋白（Marker）、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素 美国Thermo Fisher公司；牛血清白蛋白、生物素标记山羊抗人IgE抗体、胃蛋白酶（P7000）、胰酶（P3292） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

DYY-7C型电泳仪 北京六一生物科技有限公司；GenoSens 1850凝交成像分析系统、ChemiScope 3300 mini化学发光成像系统 上海勤翔科学仪器有限公司；生化培养箱 宁波莱福科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花生粗蛋白提取

参考Rezende等[18]的方法提取花生粗蛋白。挑选新鲜无虫害的花生米，去除红衣后，粉碎过40 目筛，得花生粉末。用丙酮脱脂2 次，脱脂后的花生粉末在通风橱中放置过夜，使丙酮充分挥发，得到脱脂花生粉末。取5 g脱脂花生粉末，加入25 mL Tris缓冲液（20 mmol/L、pH 7.2），室温振荡2 h后，3 000×g、4 ℃离心30 min，取上清液，将上清液10 000×g、4 ℃离心30 min，取上清液，得到粗蛋白溶液（用BCA蛋白定量试剂盒测定其蛋白质量浓度为22.36 mg/mL），贮存于-80 ℃待用。

1.3.2 体外模拟胃肠液消化

模拟胃液（stimulated gastric fluid，SGF）的配制：称取0.175 g氯化钠和350 mg胃蛋白酶，加入90 mL蒸馏水，用盐酸调节pH值至1.2，加蒸馏水定容至100 mL。模拟肠液（stimulated intestinal fluid，SIF）的配制：称取0.68 g磷酸二氢钾溶于90 mL蒸馏水中，加入1.0 g胰酶，用1 mol/L NaOH溶液调pH值至7.5，加蒸馏水定容至100 mL。SGF和SIF均现配现用。

参考Toomer等[19]的方法进行体外模拟胃肠液消化实验。分别取250 μL SGF、不含胃蛋白酶的SGF（对照）、SIF和不含胰酶的SIF（对照）加入至不同的离心管中，37 ℃恒温水浴5 min，加入一定体积的粗蛋白溶液（含800 μg蛋白），迅速漩涡振荡并快速置于37 ℃水浴锅内，准确记录时间，分别在反应的0 s、30 s、5 min、15 min、30 min和60 min时取出对应的离心管（对照管60 min取出），加入37.5 μL 1 mol/L碳酸氢钠溶液，冰浴。随后进行聚丙烯酰胺凝交电泳（sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

1.3.3 SDS-PAGE分析蛋白组成

分别制备质量分数10%的分离交和质量分数4%的浓缩交。取30 μL粗蛋白溶液，与上样缓冲液（6×）按5∶1的体积比充分混合，100 ℃煮沸5 min，离心后上样。首先以80 V恒压进行电泳，待样品指示条带进入分离交并被压成一条直线时，将电压调成120 V。待样品指示条带迁移至凝交底部时，结束电泳。取出凝交，置于染色液中缓慢摇动染色30 min。使用脱色液脱色至凝交显示出清晰条带，凝交成像仪拍照，并进行灰度分析。

1.3.4 花生主要过敏原线性B细胞表位的生物信息学分析

在致敏蛋白结构数据库（http://fermi.utmb.edu/cgibin/SDAP/）中获取花生主要过敏原Ara h 1的23 个线性B细胞表位序列，同时确定每个表位中的关键氨基酸。利用Bioedit 7.0软件对Ara h 1的线性B细胞表位中各氨基酸出现频率进行分析。在PDB数据库中获取Ara h 1的二级结构和高级结构信息，使用Cn3D 4.1软件查看线性B细胞表位在Ara h 1高级结构中的位置。

1.3.5 抗消化肽段检测

经胃蛋白酶和胰酶消化后的样品采用纳升级HPLC-Q-Exactive-MS/MS进行检测。流动相：A液为体积分数0.1%甲酸溶液，B液为体积分数0.1%甲酸-乙腈溶液。样品由自动进样器上样到05M-4252-AC Luna®C18trap捕集柱（20 mm×3 mm，0.10 mm）进行去杂质，再经色谱柱C18柱（120 mm×1.9 mm，0.15 mm）（以体积分数95% A液平衡）分离，流速为600 nL/min。质谱条件：离子源：电喷雾离子源；采集方式：正、负离子切换采集；质谱扫描方式：一级质谱全扫描加数据依赖的二级质谱扫描（Full MS/dd MS2）。

1.4 数据处理与分析

采用ExPASy PeptideMass网站（https://web.expasy.org/peptide_mass/）预测胃肠液消化Ara h 1后获得的肽段，用DSSP软件分析Ara h 1的二级结构，采用SPSS 22.0软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 花生中主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的氨基酸组成特性

在致敏蛋白结构数据库中获取花生主要过敏原Ara h 1的23 个线性B细胞表位序列，具体如表1所示。使用Bioedit软件分析各种氨基酸在23 个Ara h 1 线性B细胞抗原表位中的分布，结果如图1所示，Ara h 1的线性B细胞表位由19 种氨基酸组成，构成全序列的甲硫氨酸（Met，M）没有出现。天冬氨酸（Asp，A）、谷氨酸（Glu，E）、甘氨酸（Gly，G）、脯氨酸（Pro，P）和精氨酸（Arg，R）的出现频率较高；亲水性氨基酸和带电氨基酸（如Glu、Arg等）在Ara h 1线性B表位出现频率较高。

表1 花生主要过敏原Ara h 1的线性B细胞表位序列Table 1 IgE binding fragments of linear B cell epitope on peanut allergen Ara h 1

图1 23 个Ara h 1线性B细胞表位的氨基酸组成Fig.1 Amino acid compositions of 23 Ara h 1 epitopes

2.2 花生中主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位二级结构分析结果

为了进一步探究Ara h 1的线性B细胞表位与其二级结构之间的关系，使用DSSP二级结构分析程序计算出二级结构的分布情况。从图2可以看出，Ara h 1线性B细胞表位的二级结构主要由α-螺旋、β-片层和β-折叠组成，具有一定的回转折叠构象，全长包含418 个氨基酸，对应于Ara h 1中氨基酸序列的170～587位，涵盖了10～22号线性B细胞表位。大多数线性B细胞表位各二级结构并没有明显的分布规律，且不同表位的二级结构相差较大，还需对其高级结构进行进一步分析。

图2 Ara h 1的二级结构分布Fig.2 Secondary structure distribution of Ara h 1

2.3 花生中主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的高级结构

使用Cn3D软件将Ara h 1的10～22号线性B细胞表位标注于Ara h 1的空间结构上，即图3中深棕色单体的黄色区域。可以看到，大部分线性B细胞表位都位于单体之间的疏水相互作用结合区域，其结果也与线性B细胞表位的氨基酸组成分析结果一致性，即亲水性氨基酸在Ara h 1线性B表位中的出现频率较高。此外，有一部分线性B细胞表位埋入了Ara h 1三聚体的构象内部，不易被蛋白酶作用；另外，由于空间位阴效应，Ara h 1三级结构表现出B细胞表位被屏蔽，相比于那些露出甚至位于Ara h 1表面的表位，这些被屏蔽的表位可能需要经过变性后暴露出来才能发挥IgE结合活性。

图3 线性B细胞表位在Ara h 1三聚体三级结构中的定位Fig.3 Localization of linear B cell epitopes in tertiary structures of Ara h 1 trimer

2.4 花生主要过敏原Ara h 1抗消化片段

如图4所示，花生粗蛋白提取液在63 kDa处左右出现一条明显条带，其对应的是Ara h1。经不含胃蛋白酶的SGF和不含胰酶的SIF消化60 min后，其蛋白质条带未发生明显变化，说明提取的总花生粗蛋白在不含胃蛋白酶和胰酶的条件下具有热稳定性。经SGF、SIF消化30 s时，花生蛋白条带分布出现明显变化，大分子质量的条带变浅甚至消失，说明原样中的蛋白都被消化成小分子片段。在经SGF消化的整个过程中一直存在一条分子质量低于15 kDa的条带，在经SIF消化的整个过程中一直存在一条分子质量为10 kDa左右的抗消化片段。以上结果表明，花生提取物中的Ara h 1容易被胃蛋白酶和胰酶降解，但仍保留小分子片段，可能具有致敏活性。

图4 SGF（A）和SIF（B）消化对花生蛋白质的影响Fig.4 Effect of stimulated gastric fluid (A) and stimulated intestinal fluid (B) digestion on peanut proteins

对经过SGF或SIF消化60 min后的花生蛋白消化产物进行HPLC-MS/MS检测，鉴定出氨基酸长度超过4 个的抗消化肽段，并确定了多肽所属的蛋白质序列。花生粗蛋白经SGF消化后，共鉴定出28 条属于过敏原蛋白质的片段，其中有15 条与Ara h 1匹配（表2）。这15 条多肽覆盖了Ara h 1全序列的19.38%，且主要分布于蛋白质的氨基端。经SIF消化后，共检测出8 条属于过敏原蛋白的肽段，其中有4 条属于Ara h 1，覆盖了Ara h 1全序列的6.39%（表3）。表4和表5是ExPASy PeptideMass网站对Ara h 1分别经胃蛋白酶和胰蛋白酶酶切后的预测肽段，结果只有小部分的预测肽段与实际测定的肽段完全匹配。

表2 Ara h 1抗SGF消化的肽段在Ara h 1全序列中的分布Table 2 Distribution of peptide fragments resistant to simulated gastric digestion in the Ara h 1 sequence

表3 Ara h 1抗SIF消化的肽段在Ara h 1全序列中的分布Table 3 Distribution of peptide fragments resistant to simulated intestinal fluid digestion in the Ara h 1 sequence

表4 生物信息学预测SGF消化Ara h 1后获得的肽段Table 4 Bioinformatic prediction of the peptide fragments obtained by stimulated gastric fluid digestion of Ara h 1

表5 生物信息学预测SIF消化Ara h 1后获得的肽段Table 5 Bioinformatic prediction of the peptide fragments obtained by simulated intestinal fluid digestion of Ara h 1

2.5 抗消化肽段及预测表位在Arah1氨基酸序列的定位

如图5所示，在Ara h 1氨基酸序列的94～104、299～313、330～337、401～426、505～510、532～543、560～572以及574～582位置的抗消化多肽均与预测的线性表位存在部分氨基酸序列的交叉，证明了部分表位的抗消化性。经SGF消化后可以获取比SIF消化更多的肽段信息，可能有助于鉴定更多的线性B细胞表位。

图5 抗消化肽段及预测表位在Ara h 1氨基酸序列的定位Fig.5 Location of anti-digestive peptides and predicted epitopes in the amino acid sequence of Ara h 1

3 讨 论

本研究中采用生物信息学结合HPLC-MS/MS测定抗消化肽的方法共同检测分析Cupin超家族花生过敏原Ara h 1的线性B细胞表位。先通过过敏原结构数据库获取花生主要过敏原Ara h 1的线性B细胞表位序列，通过生物信息学分析软件归纳总结表位在氨基酸组成以及高级结构分布中的存在规律。分析发现，线性B细胞表位亲水性氨基酸含量较高。分析其二级结构，主要由α-螺旋、β-片层和β-折叠组成。分析其高级结构，IgE结合表位主要位于Ara h 1单体之间的疏水相互作用区域，有部分表位埋入三聚体构象内部。Ara h 1属于Cupin超家族，具有其典型的β桶状结构域。Cupin超家族分为7S球蛋白三聚体和11S球蛋白六聚体，研究表明，7S和11S球蛋白虽然仅约有35%～45%的氨基酸序列相近，但在三级结构上具有高度的相似性[20]。李平等分析了已经确定线性B细胞表位的Cupin家族食物过敏原，归纳出线性B细胞表位一般要具备的3 个特点：1）处于高度暴露于溶剂的区域；2）含有亲水性侧链，有利于与IgE抗体结合；3）有一定的柔韧性，便于抗原抗体的嵌合[21]。这与本实验的分析结果一致。以上分析表明Cupin超家族的过敏原线性B细胞表位特点具有高度保守性，可将花生主要过敏原Ara h 1作为模式抗原，研究其他Cupin家族内过敏原的线性B细胞表位。

特定的食物致敏蛋白要引发过敏反应，必须在其经过加工处理或机体胃肠消化系统的作用后仍然具有抗原性。因此，目前发现的食物致敏蛋白大多具有良好的热稳定性及消化酶抗性。这意味着过敏原经消化后生成的多肽片段仍然具有足够数量的抗原表位[22-23]。Prodic等研究发现花生通过口腔和胃中的酶消化后，其消化后的肽保留了过敏原能力，且从Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3中鉴定出的大量抗消化短肽是连续表位序列的一部分，并具有相当大的致敏潜力，进一步证实了抗消化肽具有致敏潜力[24]。另外，花生过敏原Ara h 1的结构也可能保护其抗原表位免受消化。为了确定Ara h 1四级结构是否在保护其免受蛋白水解作用中发挥一定作用，Maleki等将Ara h 1暴露于酸性条件下室温孵育1 h，孵育期结束时，进行Ara h 1单体之间的交联反应，并通过SDS-PAGE分析，结果表明即使在pH 2条件下孵育后，Ara h 1寡聚体仍然是稳定的，并且仍然可以结合IgE[25]。本研究结果也表明，花生过敏原Ara h 1无论是经过SGF消化还是SIF消化，所保留的抗消化肽段都可以部分与线性B细胞表位对应，但不是完全对应。并且线性B细胞表位主要位于疏水相互作用区域，部分表位埋入三聚体构象内部。即线性B细胞表位附近存在抗消化区域。

目前对于食物过敏原线性B细胞表位的研究主要应用重叠肽段合成法，其存在效率低下、合成肽段数目众多、盲目性较大的问题，不能对数目众多的食物过敏原进行高通量的预测与研究[26-28]。Wolff等鉴定发现含有71 个氨基酸的肽B为β-球蛋白上IgE结合区，为了确定结合位点的氨基酸序列，合成了长度分别为20 个和10 个氨基酸残基的重叠肽，这些肽的氨基酸序列与肽B的部分连续序列对应，通过免疫印迹法在这些重叠肽中鉴定出9 个IgE结合抗原表位[29]。另外，Pedraza-Escalona等利用克隆出的鼠单克隆抗体和3 个人类单链片段抗Hev b 6.02与天然橡交乳交主要过敏原Hev b 6.02结合筛选分析Hev b 6.02的B细胞表位[30]。噬菌体展示技术也被用于鉴定过敏原表位。通过噬菌体展示技术已经鉴定出桦树过敏原Bet v 1、尘螨过敏原Der p 1和Der p 2等的抗原表位。但是噬菌体展示技术也是基于获得特异性抗体进行表位的筛选[31-32]。以上方法主要存在工作量大以及获得特异性抗体难度大的问题，而本研究主要将Ara h 1的生物信息学和抗消化肽段结合分析，发现花生主要过敏原Ara h 1的已知线性B细胞表位与其胃肠道抗消化肽段之间具有一定的交叉性，可以通过模拟消化后鉴定的抗消化肽段，结合氨基酸组成、高级结构分布等信息，沿过敏原全序列小范围延伸检测可能的线性B细胞表位。此方法可以进一步缩小表位的范围，为检测Cupin超家族其他过敏原的线性B细胞表位提供了参考。

4 结 论

Ara h 1的线性B细胞表位富含亲水性氨基酸如精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）以及天冬氨酸（Asp）等；分析其二级结构，Ara h 1线性B细胞表位的二级结构主要由α-螺旋、β-片层和β-折叠组成，具有一定的回转折叠构象；对其三级结构进行分析发现，表位主要位于单体之间的疏水相互作用区域，部分表位埋入三聚体构象内部。其抗消化序列与表位之间存在部分重叠。综上，质谱检测体外模拟胃肠道消化肽段，并结合表位生物信息学分析，可以作为鉴定线性B细胞表位的新方法，并可为鉴定Cupin超家族过敏原线性B细胞表位和低过敏性蛋白的制备提供参考。