华北大黑鳃金龟对桃树挥发物的电生理反应

张 诺, 陈 立, 谢广林

(1. 长江大学农学院, 湖北荆州 434025; 2. 河北大学生命科学学院, 生命科学与绿色发展研究院, 河北保定 071002)

在植物与植食性昆虫长期进化过程中，植食性昆虫逐渐对寄主植物产生的某些特殊化学物质或多种化学物质的特殊比例产生较强的嗅觉反应和趋向性(Sunetal., 2014)。这些植物挥发物是植食性昆虫定位寄主的重要信号物质(姜斯琪, 2019)，在昆虫取食、交配、产卵过程中具有非常重要的作用。除视觉信息外，植食性金龟子主要利用植物挥发物进行寄主定位。例如，扁绿异丽金龟Anomalaoctiescostata对蒲公英花挥发物中的顺-3-己烯醇乙酸酯[(Z)-3-hexenyl phenylacetate]、苯甲醛(benzaldehyde)、苯乙醛(phenylacetaldehyde)、苯乙醇(phenethyl alcohol)、苯甲酸苯酯(phenyl benzoate)有强烈的趋向行为(Lealetal., 1994)。东北大黑鳃金龟Holotrichiadiomphalia对植物绿叶挥发物反-2-己烯醛[(E)-2-hexenal)]有显著的趋向行为反应(孙凡等, 2006)。(邻)氨基苯甲酸甲酯(methyl anthranilate)能够引诱红铜丽金龟Anomalarufocuprea(Maekawaetal., 1999)。丙酸苯乙酯(phenethyl propionate)、丁子香酚(eugenol)和香叶醇(geraniol)按照3∶7∶3比例混配的混合物对日本丽金龟具显著的引诱作用(Leal, 1998)。

华北大黑鳃金龟Holotrichiaoblita，属鳃金龟科(Melolonthidae)鳃金龟亚科(Melolonthinae)，在我国北方和沿海各省危害严重，是威胁农林业生产的重要地下害虫。幼虫(蛴螬)、成虫均能为害，幼虫栖息在土壤中，取食萌发的种子、根、茎，成虫取食植物叶片(Lietal., 2009)。据统计，2003和2004年河南新乡驻马店地区花生田受蛴螬危害分别占播种面积的66.7%和89.2%(罗宗秀等, 2009)。华北大黑鳃金龟成虫是一种夜行性昆虫，视觉刺激因素对其行为影响有限，寄主植物挥发物在其寄主定位的过程中起着主要的导向作用(Balkeniusetal., 2006)，因此，可利用这些挥发性化学物质开发引诱剂，达到防治目的。

桃树Prunuspersica属蔷薇目(Rosales)蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)，是多种金龟如华北大黑鳃金龟、铜绿丽金龟Anomalacorpulenta、苹毛丽金龟Proagoperthalucidula、东方绢金龟Maladeraorientalis、小黄鳃金龟Metabolusflavescens等的寄主植物，这些金龟在桃树上集中取食，轻者吃成花叶，危害严重时，会导致桃树减产、挂果推迟，甚至整株枯死(浑志英和张之新, 1992; 孙瑞红等, 2010; 刘先福, 2015; 李娅娅等, 2018; 刘雨林, 2020)。

前人的研究大多是对植物粗提物的化学分析，从中选取个别化合物的标准品进行电生理实验和行为选择试验(马艳华等, 2018; 李晓峰等, 2020)，还没有利用气相色谱-触角电位联用技术(gas chromatography-electroantennographic detection, GC-EAD)鉴定华北大黑鳃金龟寄主植物活性成分的研究报道。本研究根据金龟子成虫利用植物挥发物进行寄主定位的行为特点，通过动态顶空吸附法收集桃树枝叶挥发物，采用GC-EAD测试了华北大黑鳃金龟雌虫对桃树枝叶挥发物的反应，接着采用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)鉴定出挥发物中对华北大黑鳃金龟雌虫具有触角电生理活性的化学物质。然后将这些物质的标准品分别配制成0.001, 0.01, 0.1, 1.0和10.0 μg/μL溶液进行触角电位测定，探索不同剂量的桃树挥发性化学物质对雌、雄虫电生理反应的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料及器具

1.1.1供试昆虫：华北大黑鳃金龟成虫采集于北京市朝阳区中国科学院园区内草坪。带回实验室后，将采集的金龟放置于实验室塑料盆(20 cm×30 cm×30 cm)中，盆中装有1∶1(m/m)的沙土，塑料盆顶盖上开一些小孔，保持透气性，加适量的水于土中保持湿度。饲养12 h后用于触角电位实验。

1.1.2供试药剂：导电液配方：750 mg/mL NaCl, 35 mg/mL KCl, 29 mg/mL CaCl2·2H2O的水溶液，0.05%吐温80(Chenetal., 2019)。色谱纯正己烷、二氯甲烷购自上海安谱科学仪器有限公司；Porapak-Q(80/100目)吸附剂、内标苯甲酸甲酯(methyl benzoate)、标准化合物(罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇、壬醛、水杨酸甲酯，纯度均大于96%)均购自于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

1.1.3主要材料及器具：触角电位仪(Syntech, Kirchzarten，德国)；气相色谱-质谱联用仪(7890A-5975C, Agilent Technology, 美国)；气相色谱仪(GC-2010plus, Shimaduz, 日本)；刺激气流控制器(CS-55, 内置空气泵)；显微操作台MP-15；EAG数据记录及分析软件；采样袋(60 cm×80 cm, Reynolds Oven Bag，美国)；吸附剂Porapak Q(80～100目，Supelco，美国)；吸附管(内径5 mm)；大气采样仪QC-1S型(北京市劳动保护科学研究所，北京)。

1.2 桃树挥发物的收集

在中国科学院奥运村园区内，选取5棵桃树P.persica，每棵树重复2次，在华北大黑鳃金龟出土高峰段(19∶00-21∶00)采用动态顶空吸附法收集桃树挥发物。动态顶空吸附法参考李娅娅等(2018)，选取健康无病虫害的桃树，用采样袋套住枝条，在枝条基部放入装有活性炭的玻璃管(长20 cm，内径5 cm)，采样袋用线绳连同枝条和玻璃管绑紧，袋子顶端剪一小口插入吸附管，用线绳绑紧。用Teflon管依次连接吸附管的一端、气体流量计和大气采样仪进气口。吸附管装有经过活化的200 mg的吸附剂。大气采样仪流速为500 mL/min，采集时间为2 h。采集完成后立即用1 mL的HPLC级二氯甲烷洗脱吸附管，得0.5 mL洗脱液置于-20℃冰箱内备用。

1.3 华北大黑鳃金龟对桃树挥发物的GC-EAD反应

GC-EAD测定所用的设备和技术参考Chen等(2019)和张萌萌等(2020)。气相色谱柱为DB-WAX毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。升温程序为起始温度40℃，保持2 min，以5℃/min升至120℃，再以15℃/min升至240℃，保持4 min。进样口温度为230℃，检测器温度为240℃。载气为氮气，流速为2 mL/min。

挑选两根端口整齐且大小比华北大黑鳃金龟雌虫触角基部和顶端稍大的玻璃毛细管；将导电液充满毛细管，作为电极。挑选两根长度为5 cm的铂金丝插入两个电极中，一个为参比电极，另一个为记录电极。挑选活跃的金龟，放置在便签纸上，在解剖镜下，用手术刀由基部快速切下触角，将触角基部与充满导电液的参比电极相连，触角中间鳃瓣顶端接触记录电极。 记录电极内用铂金丝连接信号探针(EAG Combi, Syntech, Kirchzarten, 德国)，使用GC-EAD软件(GC/EAD32, version 4.4, Syntech)记录和分析数据(Chenetal., 2019)。

每次取3 μL样品进行无分流进样分析，至少得到5个成功的GC-EAD结果。若一个物质能引起雌虫触角强烈反应且能重复3次以上，则视为该物质具有电生理活性。结合GC-MS结果，鉴定出对华北大黑鳃金龟雌虫触角产生电生理反应的物质。

1.4 桃树挥发物中EAD活性成分的鉴定

EAD活性成分的鉴定参考张萌萌等(2020)。采用Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪对桃树挥发物洗脱液进行组分分析。色谱柱为DB-WAX毛细管柱(参数同上)，进样量2 μL，不分流进样。柱温升温程序：起始温度40℃，保持1 min，以5℃/min升至180℃，再以10℃/min升至240℃，保持4 min。进样口温度230℃，离子源温度250℃，质谱电离方式为EI，电离能量为70 eV，扫描质量范围40～500 amu。

根据质谱数据检索NIST08质谱库鉴定EAD活性成分的结构，并用标准品配制浓度为0.1 μg/mL的正己烷溶液，采用上述升温程序进行保留时间和质谱验证。

1.5 华北大黑鳃金龟对EAD活性挥发物标准品的EAG反应

华北大黑鳃金龟触角电生理反应所用仪器及方法参照李娅娅等(2018)。触角准备方法参照1.3节，快速切下金龟触角，与参比电极和记录电极相连，用移液枪取10 μL样品加到滤纸条(5 mm×40 mm)上，待溶剂完全挥发后(20 s)，将滤纸条放入滴管中，用大拇指堵住粗口端，30 s后将滴管中气味物质吹向鳃瓣，刺激时间为0.2 s，两次刺激之间间隔2 min，便于触角在刺激后恢复活性，空气流速为800 mL/min。使用EAG 2000软件记录。

EAD活性挥发物标准品用HPLC级正己烷稀释成0.001, 0.01, 0.1, 1.0和10 μg/μL进行EAG测试。5种EAD活性挥发物标准品的测试顺序随机，测试前后，均需使用HPLC级正己烷(对照)进行一次测试。一个触角只用于测试一个浓度下的5种化合物和溶剂对照，为一个重复，雌、雄成虫各8个重复。

1.6 数据分析

对EAG反应数据进行校正，即将同一触角对挥发物标准品的EAG反应值减去其对正己烷的EAG反应值的平均值。 采用Excel 11.0软件和SPSS 22.0统计软件进行数据分析。采用Tukey-HSD多重比较检测华北大黑鳃金龟触角在同一浓度下对不同化合物的活性(平均值±标准误， n=8)差异显著性(P<0.05)；采用t检验检测雌、雄成虫对同种测试气味物质的EAG反应差异显著性(P<0.05)；采用线性回归分析雌、雄虫对同种物质不同剂量刺激下的EAG反应差异显著性(P<0.05)。

2 结果

2.1 华北大黑鳃金龟雌成虫对桃树挥发物的GC-EAD反应

GC-EAD结果表明，有7种桃树挥发物组分可重复地引起华北大黑鳃金龟雌成虫的EAD反应(图1)，经GC-MS鉴定分别为Z-β-罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇、壬醛、水杨酸甲酯以及2种未知化合物(表1)。苯甲酸甲酯(内标)也有EAD活性(张萌萌等, 2020)。

图1 华北大黑鳃金龟雌成虫对桃树挥发物的GC-EAD反应Fig. 1 GC-EAD responses of female adults of Holotrichia oblita to volatile compounds from peach tree1: 未知Unknown; 2: Z-β-罗勒烯Z-β-Ocimene; 3: 顺-3-己烯乙酸酯Z-3-Hexenyl acetate; 4: 顺-3-己烯醇Z-3-Hexenol; 5: 壬醛Nonanal; 6: 未知Unknown; 7: 水杨酸甲酯Methyl salicylate; 8: 内标Internal control.

表1 桃树挥发物中对华北大黑鳃金龟雌成虫的GC-EAD活性物质Table 1 GC-EAD active compounds to female adults of Holotrichia oblita in peach tree volatiles

2.2 华北大黑鳃金龟成虫对5种桃树挥发物成分的EAG反应

华北大黑鳃金龟雌、雄成虫触角对供试的5种桃树挥发物成分均有明显的EAG反应(图2)。当剂量为0.01 μg时，水杨酸甲酯引起华北大黑鳃金龟雄成虫的EAG反应显著大于Z-β-罗勒烯(P<0.05)，但与其他化合物间没有显著差异(P>0.05)；雌成虫对5种化合物的EAG反应也没有显著差异(P>0.05)。当剂量为0.1 μg时，雄成虫对水杨酸甲酯的EAG反应显著大于对Z-β-罗勒烯和壬醛，雌成虫对水杨酸甲酯的EAG反应仅显著大于对Z-β-罗勒烯(P<0.05)。当剂量为1 μg和10 μg时，雌、雄成虫对5种化合物的EAG反应都没有显著差异(P>0.05)。但是当剂量达100 μg时，雌、雄成虫对壬醛和Z-β-罗勒烯的EAG反应均显著大于对顺-3-己烯乙酸酯和水杨酸甲酯(P<0.05)。

华北大黑鳃金龟雌成虫对供试的5种桃树挥发物成分在5种不同剂量刺激下的EAG反应均显著高于雄成虫(P<0.05)(图2)。随着化合物的剂量增加，EAG的反应强度呈现明显增大的趋势(表2)。当剂量达100 μg时，除水杨酸甲酯外，雌成虫触角对Z-β-罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇、壬醛的电生理反应显著大于对其余4种剂量的反应(P<0.05)；当剂量为100 μg时，雄成虫触角对Z-β-罗勒烯、顺-3-己烯醇、壬醛的电生理反应显著大于对其余4种剂量的反应(P<0.05)。

3 讨论

利用GC-EAD技术可以鉴定出桃树挥发物中能引进昆虫电生理和行为反应的化合物。本研究发现寄主植物桃树挥发物中对华北大黑鳃金龟雌成虫有EAD活性的物质共7种，已鉴定的化合物分别为Z-β-罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇、壬醛、水杨酸甲酯，这些化合物均能引起华北大黑鳃金龟雌、雄成虫较强的触角电位反应(图1)。桃树挥发物中能引起东方绢金龟触角电位反应的物质为反-2-己烯醛、顺-3-乙烯己烯酯、反-3-己烯醇(E-3-hexanol)、顺-3-己烯醇和水杨酸甲酯(张萌萌等, 2020)。由此可见，同时能引起华北大黑鳃金龟和东方绢金龟的触角电位反应的化合物为顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇和水杨酸甲酯。虽然桃树释放的植物挥发物种类很多(Najar-Rodriguezetal., 2013)，但能引起昆虫电生理反应的化合物却很少。例如桃树枝叶挥发物中引起梨小食心虫Cydiamolesta雌成虫触角电位反应的化合物为(E)-β-罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、6-甲基-庚烯-2-酮和壬醛(Lu and Qiao, 2020)，而剪切下来的桃树枝叶释放的挥发物中的电生理活性物质为(E)-β-罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇、苯甲醛和里那醇(Luetal., 2015; Lu and Qiao, 2020)。

本研究鉴定的化合物对昆虫EAG和行为的活性已有很多报道。顺-3-己烯乙酸酯、水杨酸甲酯对华北大黑鳃金龟具较强的吸引作用(邓思思等, 2011; 热孜宛古丽·阿卜杜克热木等, 2018; 刘雨林, 2020)，也能引起铜绿丽金龟较强的趋性行为反应(鞠倩等, 2016)。在10 μg剂量刺激下，顺-3-己烯醇能引起苹毛丽金龟EAG反应(路常宽等, 2009)；大栗鳃金龟Melolonthahippocastani、五月鳃金龟Melolonthamelolontha、庭园发丽金龟Phylloperthahorticola雄虫能够利用寄主植物释放的顺-3-己烯醇寻找配偶(Rutheretal., 2002; Ruther, 2004)；寄主黑豆、蓖麻、花生、赤豆、苹果释放的顺-3-己烯乙酸酯和顺-3-己烯醇对黑绒鳃金龟Sericaorientalis有较强的吸引作用(周鑫, 2014)。华北大黑鳃金龟成虫对其他植物挥发物也表现出良好的选择趋性，如雌、雄成虫对邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate)、顺-3-己烯异丁酸酯[(Z)-3-hexene isobutyrate)]、苯酚(phenol)(10 μg/μL)有极显著的趋向性(P<0.01)，但对α-水芹烯(α-phellandrene)、3-蒈烯(3-carene)、反-2-壬烯醛[(E)-2-nonenal)]有明显的负趋性(热孜宛古丽·阿卜杜克热木等, 2018)。

挥发物浓度能影响金龟触角电生理反应。同一种挥发物在浓度变化的情况下，白星花金龟Protaetiabrevitarsis雌成虫随着测试浓度的增大其触角电生理反应相对值升高，但雄成虫的电生理反应值无明显变化(王瑞笛, 2019)。东北大黑鳃金龟雌、雄成虫对反-2-己烯醛和5-甲基-1-己醇(5-methylhexan-1-ol)的EAG反应随剂量的增加而增强(孙凡等, 2006)。反-2-己烯醛、罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、壬醛、苯甲醛、石竹烯[(-)-E-caryophyllene)]、水杨酸甲酯、α-法尼烯(α-farnesene)的浓度对铜绿丽金龟的电生理反应有一定影响，但没有明显的规律(鞠倩等, 2016)。本研究鉴定的5种桃树挥发物中，同一物质在不同剂量下所引起的华北大黑鳃金龟雌、雄成虫的EAG反应不同，随着剂量增加，仅有雌虫对水杨酸甲酯、雄虫对顺-3-己烯乙酸酯和水杨酸甲酯的电生理反应与剂量不呈正相关(图2)。

金龟的性别对电生理反应有较大影响。华北大黑鳃金龟雄成虫对寄主植物(银杏、玉兰、柿树、榆树)及非寄主植物金银木挥发物的EAG反应均比雌成虫的反应小(余玉婷, 2013; 李娅娅等, 2018)。华北大黑鳃金龟雌成虫对100 μg剂量下的20种植物挥发物的EAG反应大于雄成虫，其中顺-3-己烯乙酸酯、辛醛、柠檬烯引起雌、雄虫的EAG值达显著性差异(邓思思等, 2011)。东北大黑鳃金龟雌成虫对反-2-己烯醛和5-甲基-1-己醇的EAG反应均高于雄成虫(孙凡等, 2006)。暗黑鳃金龟雌成虫触角对丙酸苯乙酯和香叶醇的EAG反应值显著大于雄成虫(衣建坤, 2019)。白星花金龟雌、雄成虫对寄主植物所产生的33种醇、醛类气味物质有较强的EAG反应，雌虫的EAG反应明显大过雄虫(龚建等, 2017)。本研究发现华北大黑鳃金龟雌、雄成虫对同种气味物质的EAG反应值有显著性差异(图2)，而且采用了5个剂量进行测试，探索浓度对雌、雄成虫的影响，更具说服力。

华北大黑鳃金龟成虫对5种气味物质的EAG反应存在性别差异，可能与雌、雄成虫感器的数量、分布及类别有关。孙凡等(2007)在观察东北大黑鳃金龟触角嗅觉感器的超微结构时，推测板形感器可能用于感受植物气味。华北大黑鳃金龟雌、雄个体间触角感器种类相同，每种感器的分布无明显差异，但感器数目相差很大(杜潇等, 2015)。由此推测华北大黑鳃金龟雌成虫触角上板形感器的数目大于雄虫，可以通过扫描电镜做进一步的研究。

综上，所测的5种桃树挥发物成分均能引起华北大黑鳃金龟成虫的电生理反应，对研究开发华北大黑鳃金龟引诱剂具有一定的参考价值，但EAG反应值能否代表华北大黑鳃金龟对被测试挥发物具有相应的行为反应，还有待进一步的行为反应和田间诱集试验进行验证。本研究发现植物挥发物的剂量对华北大黑鳃金龟雌、雄成虫电生理反应的影响较大，说明金龟子雌虫先定位到寄主植物，再释放性信息素吸引雄虫完成交配，从而提高繁殖效率；雌虫快速定位到寄主植物，完成产卵，对该种群的繁衍有益。