禽流感病毒血凝与血凝抑制试验影响因素

蒋庭松 王红梅 刘黔峰

摘要：血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验是监测病毒感染的重要手段，可鉴定禽流感病毒的分离株，检测禽血清中抗体或免疫抗体情况，是免疫效果评估及疫情监测的重要科学方法。该文就血凝和血凝抑制试验操作过程中的材料准备、操作注意事项及试验结果判断等几方面进行阐述，以期避免试验中的类似问题，影响结果的准确性。

关键词：血凝与血凝抑制试验;耗材;试验操作;结果判定

中图分类号：S858.31文献标识码：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.24.010

Analysis of Matters Needing Attention on Hemagglutination and Hemagglutination Inhibition Test of Avian Influenza Virus JIANG Tingsong，WANG Hongmei，LIU Qianfeng

（Animal Disease Prevention and Control Center of Guanyang County，Guilin Guangxi 541600，China）

Abstract：The hemagglutination （HA）and hemagglutination inhibition （HI）test is currently an important means of monitoring viral infections. This test can be used to identify isolates of avian influenza virus and detect antibodies or immunity in avian serum infected with avian influenza virus. Antibody status is an important scientific method for evaluating immune effects and epidemic detection. This article elaborates on the preparation of materials，precautions for the test operation，and the judgment of test results during the operation of the blood coagulation inhibition test，in order to help readers avoid similar problems in future tests，which will affect the test. The accuracy of the results.

Keywords ：blood coagulation and blood coagulation inhibition test，consumables used，test operation，result judgment

0引言

血凝（HA）是指有些病毒的血凝素使一些動物的红细胞产生凝集。而血凝抑制（HI）则是抗体特异性地附着在HA分子的抗原位点上，干扰HA与红细胞受体的结合，抑制HA凝集红细胞的能力。这两种方法应用在病毒鉴定、抗原变异、抗体效价监测以及病毒性疾病的诊断等方面，也是新城疫免疫效果以及禽流感疫情的主要监测手段，操作简单，反应速度快，灵敏度较高，可批量化监测。但操作过程中很容易受其他因素的影响，导致检测结果不准确。因此，为保证检测结果准确性，应避免各种因素的影响。

1影响因素

血凝和血凝抑制试验影响因素主要有以下几个方面：红细胞、抗原配制、稀释液（PBS）、试验温度、试验耗材、加样操作、稀释操作、反应时间、非特异凝集素等。

1.1红细胞

红细胞悬液浓度是影响试验准确性的重要因素之一，不同个体对抗原敏感性不同。为避免鸡只红细胞发生自凝，在配制1%红细胞悬液时，要求至少使用3只SPF（Specific Pathogen Free，无特定病原）级或无禽流感和新城疫抗体的健康成年公鸡。

制备红细胞悬液时，采集抗凝血液与阿氏液等体积混合，使用PBS缓冲液，以2 000r/min离心5～10 min，重复3次。一定要保证冲洗干净血液中的白细胞，否则会增加非特异性反应，影响试验结果。洗涤后按照1份红细胞和99份缓冲液的比例配制成悬液，于4 ℃保存备用。但是配制好的1%红细胞悬液不能长期保存，超过3 d后，需另行配制。若配置好的红细胞悬液出现溶血，一定要重新配置，不能继续使用[1]。

1.2抗原配制

1.2.14单位抗原配制

配制浓度必须准确，抗原浓度高，抗体效价偏低;抗原浓度低，抗体效价偏高。配制4单位抗原时，配制人员需检查血凝价是否准确，然后进行系列稀释，使最终稀释度为1：2、1：3、1：4、1：5、1：6和1：7。每一稀释度取0.025 mL，加入PBS 0.025 mL，再加入1%鸡红细胞悬液0.025 mL，混匀。将血凝反应板在室温（约20 ℃）静置40 min或4 ℃下静置60 min。如果配制的抗原液为4单位，则1：4稀释度为凝集终点;如果高于4单位，1：5或1：6可能为终点;如果低于4单位，1 ：2或1 ：3可能为终点。

1.2.24单位抗原标定

在微量反应板的第2～6孔均加入25 μL PBS或生理盐水，吸取25 μL配制好的4单位抗原加入第1和第2孔。从第2孔倍比稀释至第5孔，第5孔吸取25 μL弃之，第6孔加入稀释液作为对照。每孔再加入25μL PBS或生理盐水，然后再加入25 μL 1%鸡红细胞悬液。振荡混匀，在室温（20～25 ℃）下静置20～30 min，观察结果。对照孔红细胞将呈明显的小圆点沉到孔底。分装标定好的4单位抗原在离心管中，并做好标记，避免抗原反复解冻，影响效价。

1.3稀释液

试验应选用合适的稀释液种类，一般选择PBS缓冲液或生理盐水。另外，在进行血凝试验、血凝抑制试验及洗涤红血球时均需采用同一种稀释液。稀释液pH值也会对试验的结果产生影响，如pH值为7.0时，红细胞沉降最充分，图形最清晰，HI效价也最高;当pH值在5.8以下时，红细胞容易产生自凝现象;pH值在7.8以上时，凝集图形易解脱，也会造成试验误差。因此，试验时建议稀释液pH为7.0～7.2[2]。

1.4温度

血凝和血凝抑制试验对温度的要求较高，一般在20～25 ℃的室温下静置30～40 min即可，温度过高或者过低均会影响试验结果。从4～37 ℃，随着温度上升，HA与HI滴度会逐渐提高。但在37 ℃时，凝集的红细胞易解脱，使得红细胞的沉降速度过快，影响试验准确性;4 ℃以下时，红细胞易产生自凝，并且试验反应的速度很慢。因此，试验时应注意保持合适的温度。

1.5试验耗材

1.5.1微量反应板

微量反应板有90°V型板和110°V型板。90°V型板的角度比110°V型板的角度小，红细胞沉降速度快，形成的凝集图像清晰、判定结果相对容易。因此，血凝和血凝抑制试验时建议使用90°V型板。

1.5.2移液器

试验时移液器量程越精确，检测结果就越准确。HA与HI试验中加样体积为25 μL，因此，与20～200 μL量程移液器相比，选择10～100 μL量程移液器的检测精确度更高。

1.6加样、稀释操作

倍比稀释时，每孔的吹吸次数应该一致，至少反复吹吸6次，以使其充分均匀混合，还应注意尽量避免产生泡沫。加抗原及红细胞时，不要让吸头碰到反应板，以免产生污染，影响试验准确度。加样、稀释时，应高度集中注意，以免漏加、重复加样等。

1.7反应时间

血凝与血凝抑制试验应在规定时间内发生反应。若反应时间过短，细胞凝集不完全;反应时间过长，则容易出现洗脱。反应时间超出正常时间10 min，会导致红细胞裂解，试验结果无说明意义[1]。

1.8非特异凝集素

有些禽类（如鸭、鹅等水禽及鸽）血清可能对鸡红细胞产生非特异性凝集，可先用待检血清做HA试验。如待检血清出现红细胞凝集，则说明存在非特异凝集因子，宜用鸡红细胞吸附待检血清，具体方法为：每0.5 mL待检血清中加入0.025 mL 50%鸡红细胞，轻摇后至少静置30 min。离心2～5 min，收集上清液进行HI试验。或者用与待检血清同一宿主的1%红细胞悬液进行HA和HI试验。

2结果判定

除试验材料与操作技术等会对血凝和血凝抑制试验的结果产生影响外，实验员对结果的判定也会影响准确性。正常试验结果为病毒所在的对照孔发生完全凝集，而稀释液对照孔无凝集，因此每次试验均应设立对照组[3]。对照结果正确的情况下，实验员可以倾斜反应板，从背面观察红细胞的凝集情况，需控制观察时间，当阳性血清反应后就迅速观察。当出现整板无红细胞凝集或者整板红细胞凝集时，则无法进行结果判断，这时需查找原因，重新开展试验。

3结束语

血凝和血凝抑制试验是检测禽流感等传染性疾病非常有价值的方法，试验方便、快捷且检测成本较低，一直被广泛应用，但其准确性却容易受到多种因素的影响。在试验过程中，实验员必须注重每个细节，从试验材料的准备到操作过程都应该严格按照相关试验标准进行，保证各试验环节的操作質量，有效降低操作误差。此外，在结果判定时也应按照专业方法准确判断，为禽流感等传染性疾病的预防和控制提供可靠参考。

参考文献

[1]杜秋阳，高沙沙，赵协，等.影响血凝和血凝抑制试验的因素及分析[J].河南畜牧兽医（综合版），2019，40（8）：39-40.

[2]王宁.浅谈血凝和血凝抑制试验操作要点[J].中国畜禽种业，2020，16（3）：53.

[3]鲁卫红.禽流感血凝和血凝抑制试验操作[J].兽医导刊，2020（17）：123.