慢性自发性荨麻疹患者的血清抗幽门螺杆菌抗体研究

吴登艳，杜茂涛，谭燃景

重庆医科大学 附属第二医院，重庆 400010

慢性荨麻疹(Chronic urticaria，CU)是以反复发生的风团、瘙痒为主要表现的常见疾病，病程常迁延达6周以上．CU的病因复杂且隐匿，因此将大多数(>80%)无明显诱因的CU归为慢性自发性荨麻疹(Chronic spontaneous urticaria，CSU)[1]．大量研究表明，CSU患者常同时伴随幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染，经规范抗Hp治疗后，大部分患者的荨麻疹症状可得到缓解或完全消退，这些研究均提示Hp感染和CSU发病有着非常密切的相关性[2-5]．

肥大细胞的激活是荨麻疹发病的关键，它常由其胞膜外的FcεRI受体和IgE交联触发[1]．关于Hp相关体液免疫与CU发病机制的研究一直热度不断，Hizal等[6]发现血清抗Hp IgG阳性的荨麻疹患者自体血清皮肤试验阳性率(40%)显著高于血清抗Hp IgG阴性的荨麻疹患者(14.3%)，而自体皮肤血清试验已被广泛用于检测与CSU发病密切相关的抗肥大细胞FcεRI抗体，Sun等[7]也发现抗Hp抗体阳性和抗TGAb阳性的CU患者血清抗FcεRI抗体阳性率较对照组显著增高．但也有一些研究表示Hp感染与致CSU发病的自身抗体的产生无关[8]．Hp是一种能长期定植于胃肠道粘膜上皮细胞的微需氧革兰氏阴性杆菌，宿主持续的带菌状态可产生特异性体液免疫，导致感染局部粘膜和全身抗Hp特异性抗体高表达，包括IgA，IgE和IgG类抗体．鉴于肥大细胞的胞膜外尚有多种正性效应的受体，除了对IgE表现高亲和力的FcεRI受体外，循环免疫复合物受体、低亲和力的IgG受体、补体受体等的特异性结合也可促使肥大细胞活化．Acua等[9]对30例CU进行检测，其中血抗Hp IgG抗体阳性率为60.0%，IgM阳性率为33.3%；Galadari等[10]也发现血清抗Hp IgG，IgM抗体阳性率在CU患者中显著增高；Rostamy等[11]对43例CU患者血清特异性抗Hp-IgG，IgA，IgG联合IgA进行检测，发现阳性率分别为72.1%，46.5%和44.18%，与40例正常对照(37.5%，40%，27.5%)比较差异具有统计学意义；Liutu等[12]甚至用免疫印迹的方法在Hp中发现了IgE结合表位，提示Hp诱导的循环细菌特异性抗体可能在CU发病中起了重要作用．更早期的研究对比均伴Hp感染的CU及非CU患者，前组可检出高滴度血清抗Hp-Lpp20蛋白的IgG，IgA抗体，这也是目前为止仅有的一项提出Hp具体蛋白成分特异性抗体参与CU发病的研究[13]．但到目前为止，Hp介导的体液免疫和CU/CSU发病的相关研究样本数量较少，针对大样本的CSU血清抗Hp和其Lpp20蛋白抗体水平的研究鲜有报道，迫切需要在CSU大样本中调研Hp特异性抗体水平，并探讨其可能的致病机制．本研究拟纳入较大样本的CSU患者及对照组，检测各组血清抗Hp和抗Hp-Lpp20的IgE、IgG 和IgA水平，明确抗体分布情况，并探讨Hp感染促发的体液免疫在CSU发病中的角色及可能的机制．

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 血清样本、菌株、质粒

CSU病例的血清样本： 2014年7月-2015年1月在重庆大坪医院就诊并确诊为CSU的211例患者，其中112例女性(排除妊娠)，99例男性，年龄为14-69周岁(38.79±4.22岁)．本研究纳入的CSU： ① 均符合2018年欧洲变态反应和临床免疫学(EAACI)会议的CSU诊断标准[1]；② 病程6周至7年不等，平均1.8年；③ 无用药史，近一周否认抗组胺治疗，近一月否认使用糖皮质激素、免疫抑制剂；④ 否认重大基础疾病及遗传、传染病病史；⑤ 从未接受过规范的抗Hp治疗．健康对照组的血清样本： 同期大坪医院体检中心常规体检结果正常的志愿者，对照组在年龄、性别等一般条件上与CSU组匹配．纳入志愿者137例，其中73例女性(排除妊娠)，64例男性，年龄为18-66周岁(38.29±3.37岁)．纳入的对照组： ① 无过敏性疾病病史；② 一般检查无异常(二便、血常规，肝肾功)；③ 无重大基础疾病及遗传、传染病病史；④ 从未接受过规范的抗Hp治疗．EDTA抗凝管收集各受试者外周静脉血，2 h内静置离心、收集血清．菌株和质粒 Hp 26695标准株购自美国菌种保藏中心 (ATCC)；BL21(DE3) 感受态大肠杆菌购自北京天根公司；由本实验室制备的pET22b-Lpp20 重组质粒已转入DH5α感受态大肠杆菌，氨苄西林(Amp)抗性[14]．

1.1.2 主要试剂

标准Hp-ELISA血清检测试剂盒购于北京贝尔生物公司；质粒抽提试剂盒购于Omega公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒购于北京达科为公司；Chelating Sepharose Fast Flow纯化柱购于Pharmacia 公司；生物素-山羊抗人IgE，IgA购自英国AbD serotec公司；HRP-羊抗人IgG购自北京中杉公司；HRP-链霉亲和素购自美国Abbkine公司；TMB显色液购于北京天根公司；BCA蛋白浓度试剂盒购于Sigma公司；ECL化学发光试剂盒购于上海碧云天公司；N-端测序送中国科学院测定．

1.2 试验方法

1.2.1 Hp感染阳性率测定

用标准的Hp-ELISA试剂盒就CSU组和对照组Hp感染阳性率(抗CagA及HSP联合抗原的IgG抗体)进行检测．具体操作严格遵守说明书，酶标仪450 nm读取OD值．

1.2.2 血清特异性抗Hp全菌抗原IgG，IgE和IgA抗体检测

(1) Hp的培养和菌体尿素裂解液的制备

① 细菌培养[14]： 将保种的Hp菌液接种于固体Hp培养基上37 ℃培养长出的菌落，再次接种入布氏肉汤培养基(含10%胎牛血清)扩增到对数分裂期．② Hp尿素裂解液的制备： 菌液用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)重悬洗涤3次，离心后将菌体沉淀加入尿素溶液(8 M)中，充分吹打后即成，BCA法测蛋白质量浓度．

(2) 抗Hp-IgG，IgE和IgA抗体水平测定

① 间接ELISA法测定抗Hp-IgG： 20 μg/mL的Hp尿素裂解液包被酶标板，加入1∶40稀释血清100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板后加入1∶3 000稀释的HRP-羊抗人IgG 100 μL/孔，孵育1 h，洗板后拍干板中液体，加入显色液避光显色15 min，终止反应，450 nm读取OD值．每样本设3复孔，同时设无血清对照孔．② 生物素-亲和素ELISA法测定抗Hp-IgE/IgA： 将各血清1∶20稀释后加样入Hp尿素裂解液包被的酶标板，37 ℃，1 h孵育后洗板，加入1∶10 000的生物素-山羊抗人IgE或 1∶2 000的生物素-山羊抗人IgA孵育1 h，洗板，加入1∶6 000 HRP-链霉亲和素孵育35 min，加入TMB显色液显色20 min，终止反应，450 nm读取光密度(OD)值．同时设置复孔及无血清对照．

1.2.3 血清特异抗Hp-Lpp20-IgG、IgE和IgA抗体检测

(1) Lpp20的表达和纯化[14]

将pET22b-Lpp20-DH5α菌液培养扩增后提取重组质粒DNA并经NdeI+XhoI双酶切鉴定正确，再将质粒转入感受态BL21(DE3)中，构建工程菌pET22b-Lpp20-BL21(DE3)并诱导质粒表达．SDS-PAGE凝胶电泳法鉴定重组Lpp20蛋白的表达，镍离子亲和层析法纯化蛋白，蛋白浓度测定(BCA)法测定浓度，并送中国科学院进行N-端测序，增强化学发光法鉴定Lpp20重组蛋白的抗原反应性．

(2) 抗Lpp20-IgG，IgE，IgA抗体水平测定

取Lpp20以5 μg/mL的质量浓度，将各血清1∶20稀释加入包被好的酶标版中，检测各样本中抗Lpp20-IgG，IgE，IgA抗体水平．同时设置复孔及无血清对照．

1.3 统计学方法

使用GraphPad Prism 5.0统计软件进行数据分析并作图，Hp感染的阳性率(%)行卡方检验比较，p小于0.05判定为差异具有统计学意义；正态计量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间进行非配对t检验比较，p小于0.05判定为差异具有统计学意义．

2 结 果

2.1 CSU组和对照组Hp感染阳性率

CSU组和对照组均进行血清抗Hp-ELISA标准试剂盒检测，结果表明，在CSU组中，抗Hp抗体阳性率为73.46%(155/211)，对照组中阳性率为51.82%(71/137)，两组行卡方检验(χ2=17.08，p=0.000)具有统计学意义(表1)，可认为CSU发病与Hp感染有密切的相关性．

1. Marker；2-6. 不同条件下的收集管；7. 目的蛋白．图2 SDS-PAGE凝胶电泳检测重组Lpp20蛋白的纯化

表1 CSU组和对照组的血清抗Hp抗体ELISA标准试剂盒阳性率

1. 诱导前的pET22b-Lpp20-BL21；2. IPTG诱导4 h；3. 空载体pET22b /BL21由IPTG诱导4 h．图1 SDS-PAGE凝胶电泳检测重组蛋白Lpp20的表达

2.2 Lpp20重组蛋白的表达、纯化和鉴定

将诱导表达的pET22b-Lpp20-BL21用SDS-PAGE凝胶蛋白电泳进行检测，诱导4 h的工程菌在20 kDa附近有新的蛋白表达条带，目的蛋白表达成功(图1)．目的蛋白的纯化使用镍离子亲和层析法，将不同设置参数下的收集液分别用SDS-PAGE电泳进行检测，其中目的蛋白纯度可达90%，经分子筛浓缩后BCA法测定蛋白质量浓度为2.2 mg/mL(图2)．重组蛋白的N端测序为NH2-Met-Lys-Asn-Gln-Val，Fasta将此序列与蛋白质数据库进行比较，与预期的Lpp20的N-端蛋白序列一致；重组Lpp20蛋白经增强化学发光法鉴定具有良好的抗原反应性(图略)．

2.3 CSU组及对照组的血清抗Hp全菌抗原和抗Lpp20的 IgE，IgG及IgA水平

通过2.1的结果，将CSU组分为： ①CSU(+)Hp(+)组，计155例，②CSU(+)Hp(-)组，计56例；将对照组分为： ③CSU(-)Hp(+)组，计71例，④CSU(-)Hp(-)组，计66例．经生物素-亲和素ELISA法测定显示，抗Hp-及抗Lpp20-IgE分别在①，②组间(0.082±0.002 vs 0.074±0.003，p1=0.076；0.085±0.003 vs 0.083±0.003，p2=0.622)；①，③组间(0.082±0.002 vs 0.078±0.003，p1=0.382；0.085±0.003 vs 0.082±0.005，p2=0.597)比较，差异不具有统计学意义(图3a、图3d)．

a. ①CSU(+)Hp(+)组抗Hp全菌-IgE(0.082±0.002)，vs②CSU(+)Hp(-)组(0.074±0.003)、vs③CSU(-)Hp(+)组(0.078±0.003)，t1=1.785，P1=0.076，t2=0.877，P2=0.382．b. ①组抗Hp全菌-IgG(1.053±0.022)，vs②组(0.890±0.028)、vs③组(1.222±0.034)，t1=4.256，P1=0.000，t2=4.312，P2=0.000，③组vs④CSU(-)Hp(-)组(0.816±0.020)，t3=10.20，P3=0.000．c. ①组抗Hp全菌-IgA(0.660±0.022)，vs②组(0.559±0.030)、vs③组(0.849±0.037)，t1=2.600，P1=0.01，t2=2.381，P2=0.019；③组vs④组(0.730±0.032)，t3=4.63，P3=0.000．d. ①组抗Lpp20-IgE(0.085±0.003)，vs②组(0.083±0.003)、vs③组(0.082±0.005)，t1=0.494，P1=0.622，t2=0.530，P2=0.597．e. ①组抗Lpp20-IgG(1.459±0.012)，vs②组(1.422±0.019)、vs③组(1.494±0.016)，t1=1.631，P1=0.105，t2=1.720，P2=0.087；③组vs④组(1.449±0.016)，t3=2.017，P3=0.046．f. ①组抗Lpp20-IgA(1.229±0.020)，vs②组(1.124 ±0.033)、vs③组(1.251±0.033)，t1=2.813，P1=0.005，t2=0.602，P2=0.548；③组vs④组(1.098±0.035)，t3=3.171，P3=0.002．H. pylori： 幽门螺杆菌．抗体水平用均数±标准差(x±s)表示．图3 CSU组及对照组血清抗Hp全菌-和抗Lpp20-IgE，IgG，IgA水平

经间接ELISA法测定显示，抗Hp-IgG在①，②组间(1.053±0.022 vs 0.890±0.028，p=0.000)，③，④组间(1.222±0.034 vs 0.816±0.020，p=0.000)比较，差异具有统计学意义，表明Hp感染后，人群中血清抗Hp全菌-IgG水平显著升高；①，③组间(1.053±0.022 vs 1.222±0.034，p=0.000)比较，①组抗体水平明显低于③组，且差异具有统计学意义(图3b)．抗Lpp20-IgG在①，②组间(1.459±0.012 vs 1.422±0.019，p=0.10)，①，③组间(1.459±0.012 vs 1.494±0.016，p=0.087)比较，差异不具有统计学意义；但③，④组间(1.494±0.016 vs 1.449±0.016，p=0.046)比较，差异具有统计学意义(图3e)．经生物素-亲和素ELISA法测定显示，抗Hp-IgA在①，②组间(0.660±0.02 vs 0.559±0.030，p=0.01)，③，④组间(0.849±0.037 vs 0.730±0.032，p=0.000)比较，差异具有统计学意义，表明Hp感染后，人群中血清抗Hp全菌-IgA水平显著升高；①，③组间(0.660±0.02 vs 0.849±0.037，p=0.019)比较，①组水平低于③组，且差异具有统计学意义(图3c)．抗Lpp20-IgA在①，②组间(1.229±0.020 vs 1.124 ±0.033，p=0.005)，③，④组间(1.251±0.033 vs 1.098±0.035，p=0.002)比较，差异具有统计学意义，表明Hp感染后人群中血清抗Hp-Lpp20-IgA水平显著升高；但是①，③组间(1.229±0.020 vs 1.251±0.033，p=0548)比较，差异不具有统计学意义(图3f)．

3 讨 论

越来越多的研究揭示了CSU发病与Hp感染相关[2-5]，在EAACI最新发布的荨麻疹诊疗指南中，已将检测Hp感染情况纳入CSU常规诊疗计划中[1]．本研究首先用标准化Hp-ELISA试剂盒检测了CSU人群和健康对照中Hp感染阳性率(包括既往感染和现症感染)，数据显示CSU人群中Hp感染阳性率明显高于健康对照，证明Hp感染和CSU发病存在密切的相关性(表1)．荨麻疹发生的关键病理机制是肥大细胞活化、脱颗粒，继而合成和释放炎性介质，而其中最经典的肥大细胞激活途径是IgE与其胞膜外的FcεRI受体病理性结合，Hizal等[6]发现血清抗Hp IgG阳性的荨麻疹患者自体血清皮肤试验阳性率(40%)显著高于血清抗Hp IgG阴性的荨麻疹患者(14.3%)，而自体皮肤血清试验已被广泛用于检测与CSU发病密切相关的抗肥大细胞FcεRI抗体，Sun等[7]也发现抗Hp抗体阳性和抗TGAb阳性的CU患者血清抗FcεRI抗体阳性率较对照组显著增高，提示Hp感染可能通过诱导产生外周血抗FcεRI抗体升高的途径促进荨麻疹发生；但也有一些研究表示Hp感染和致CSU发病的自身抗体的产生无关．同时，肥大细胞表面仍分布有其它正性调节受体，如循环免疫复合物受体、IgG受体等，这些受体在特异性体液免疫亢进时和相应的配体结合，也能够引起细胞活化，促进后继炎症反应[1]．感染Hp后的长期带菌状态可使宿主产生持续性体液免疫，导致感染局部粘膜和循环抗Hp抗体水平增加，包括IgG，IgA 和IgE等，虽然这些抗体对于清除Hp定植作用甚微，却可能在其他病理机制中发挥作用．如已有研究揭示，在伴随Hp感染的CU病例中，血清抗Hp-IgG，IgA水平显著高于伴随Hp感染的非CU对照．Bakos等[13]的研究也发现，在伴随Hp感染的CU受试组中，存在高滴度血清抗Hp-Lpp20-IgG及IgA，这些研究都提示Hp感染介导的体液免疫可能在某些CU发病中发挥了重要作用．但既往相关研究纳入的样本量极少，迄今未见关于大样本CSU中Hp全菌及Lpp20血清特异性抗体的调研分析，因此本研究就CSU患者和健康对照中抗Hp全菌和其Lpp20血清特异性的IgE，IgG和IgA水平进行调研，以期揭示Hp引起的体液免疫在CSU发病中所扮演的角色．

本研究通过对受试血清样本细菌特异性IgE进行检测发现，在各受试组中(CSU(+)Hp(+)组、CSU(-)Hp(+)组、CSU(+)Hp(-)组、CSU(-)Hp(-)组)，血清特异性抗Hp全菌-和Lpp20-IgE抗体均处于差异不具有统计学意义的低值水平(组间比较p均大于0.05)(图3a、图3d)，表明Hp感染不能有效激发机体的IgE型体液免疫，且所产生的低水平细菌特异性IgE与CSU发病无相关性．通过检测受试血清中细菌特异性IgG发现，不论在CSU组还是对照组，感染Hp后均能引起外周循环中抗Hp全菌-IgG显著升高(p<0.05)，但CSU(+)Hp(+)组中抗Hp全菌-IgG水平显著低于CSU(-)Hp(+)组(p<0.001，图3b)，揭示在CSU人群中，Hp感染后激发IgG型体液免疫的强度远远小于无CSU人群，我们因此推测虽然感染Hp可诱导宿主产生高水平特异性的IgG抗体，但是这种体液免疫效应并不是促进CSU发病的重要病理机制．同样的，不论在CSU组还是对照组中，感染Hp后血清中抗Lpp20-IgG水平均升高，但这种升高趋势只在CSU(-)Hp(+)组中差异具有统计学意义，并且CSU(+)Hp(+)组血清抗Lpp20-IgG水平也低于CSU(-)Hp(+)组，但两组间差异不具有统计学意义(图3e)，因此我们认为Hp感染可以通过其Lpp20蛋白诱导宿主产生较高水平的血清特异性IgG，虽然Lpp20是Hp中具备良好免疫原性的成分蛋白，但它却不是Hp感染致CSU发病的重要病因．通过检测受试血清细菌特异性IgA发现，不论在CSU组或对照组，感染Hp后都会引起血清抗Hp全菌-和抗Lpp20-IgA显著升高(p<0.05)，且CSU(+)Hp(+)组中血清特异性抗Hp全菌-IgA水平显著低于CSU(-)Hp(+)组(p<0.05)，而这两组间的抗Lpp20-IgA水平差异不具有统计学意义(图3c、图3f)．我们推测，虽然感染Hp可激发宿主产生血清高水平特异性IgA，而Hp-Lpp20又是参与此反应的具备良好免疫原性的成分，但是这种IgA型体液免疫反应并非Hp感染相关性CSU的主要致病机制．至于CSU(+)Hp(+)组中抗Hp全菌-IgG，IgA水平较CSU(-)Hp(+)组更低(p<0.05)，我们推测是由于部分病例Hp感染后更向Th1型免疫反应偏移[15]，表现为血清抗体水平低，而胃肠道粘膜细胞免疫增强使粘膜损伤更严重，细菌或其代谢产物可直接接触胃肠道固有层肥大细胞，进一步使其活化而诱发包括荨麻疹在内的炎症反应；或者也可能是CSU宿主在荨麻疹炎症状态和Hp感染定植的相互作用下，能够通过某些机制削弱Hp介导的体液免疫反应．已有研究表明，CU患者血清sIL-2R水平与类胰蛋白酶水平显著相关，提示CU患者T细胞活化与肥大细胞脱颗粒成正比，CU患者具有更亢进的外周血T细胞活性[16]．

我们有理由推断，虽然感染Hp可以导致宿主产生高水平的血清特异性IgG，IgA，并且Hp-Lpp20因具备良好的免疫原性；也在Hp感染触发的体液免疫中占有重要权重，但在与Hp感染相关的CSU病程中，Hp细菌特异性抗体的产生并不是主要致病机制，也即Hp并不是通过诱发体液免疫促进CSU发病．我们认为，机体感染Hp后存在除体液免疫外的其他一些途径促进肥大细胞活化参与CSU发病．已经有一些研究表明，某些Hp蛋白如VacA和NAP，可通过引起肥大细胞的胞内钙振荡或G蛋白介导的MAPK，PI3K/Akt信号通路活化的方式直接激活人肥大细胞[17-18]，提示Hp感染后极有可能通过直接作用的方式活化粘膜固有层肥大细胞，促进CSU发病．我们的研究成果也更加全面地对Hp这种直接活化肥大细胞的方式做了补充[19]．

本研究揭示了Hp感染和CSU发病的相关性，首次在大样本的CSU病例中调研了血清特异性抗Hp全菌-及Lpp20-IgE，IgG，IgA水平，论证了Hp血清特异性抗体并非Hp感染相关性CSU的病因．虽然我们的研究并未完全揭示Hp感染致CSU的发病机制，但却给相关研究提供了新的思路，避免了某些研究资源的浪费．