基于网络药理学探讨参附强心丸治疗心力衰竭的机制

郭丽君， 马晓昌

(1.中国中医科学院西苑医院心血管病中心，北京 100091；2.国家中医心血管病临床医学研究中心，北京 100091；3.北京中医药大学西苑临床医学院，北京 100029)

心力衰竭(以下简称心衰)是各种心脏疾病的严重表现或晚期阶段，死亡率和再住院率居高不下[1]。中国心衰患者注册登记研究(China-HF)显示住院心衰患者病死率为(4.1±0.3)%[2]。心衰治疗及执行的改善虽然提高了HFrEF(heart failure with reduced ejection fraction)的生存率，降低了住院率，但预后仍不尽人意，5年内HF死亡率高达50%[3]。在心衰的防治过程中，中医药因具有多途径、多环节、多靶点的作用特点，在控制症状、降低病死率及再住院率等方面显示出独特优势。

参附强心丸是天津中医医院马连珍主任医师的临床经验方，由《金匮要略》中的己椒苈黄丸和《妇人良方》中的参附汤化裁而来。该方具有益气助阳、强心利水的功效，用于治疗慢性心衰，由人参、附子(制)、桑白皮、葶苈子、猪苓、大黄组成。人参、附子、猪苓、桑皮、葶苈子同治心、肾、肺、脾，以固心肾之阳气，健脾肃肺，利水去湿肿。大黄既活血又清肠热，为通补合剂。药理研究表明人参皂苷Rc在抗炎、抗氧化、调血脂等方面疗效显著[4]。附子具有强心、抗心律失常、降压、镇痛等作用[5]。参附联用可以抑制神经内分泌系统过度激活，降低BNP水平、减少JAK1、STAT3 蛋白表达，抑制心肌重塑，改善心肌舒缩功能[6]。葶苈子具有强心、抗菌、调血脂等作用[7]。桑白皮具有降血脂、镇痛、抗炎等功能[8]。猪苓具有利尿、抗炎、抗氧化[9]。大黄主要有抗炎、保护心脑血管、抗衰老等药理作用[10]。由于中药复方化学成分的复杂性和功能主治的多样性，参附强心丸治疗心衰作用机制尚不明确，因此借助生物信息学分析方法，挖掘参附强心丸主要作用靶点，为防治心衰的机制研究提供参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 数据库和软件主要包括为BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、GeneCards(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)、OMIM(https://www.omim.org/)、MalaCards(https://www.malacards.org/)、TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)、Uniprot(https://www.uniprot.org)、VENNY2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、STRING(https://string-db.org)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)、易汉博生物信息在线作图网站(http://www.ehbio.com/ImageGP/)、Cytoscape3.7.1软件和cytoHubba插件、ClueGo 插件。

1.2 参附强心丸活性成分筛选及靶点预测 通过中药分子机制的生物信息学分析工具BATMAN-TCM[11]来进行分析，该数据库并不是简单的通过整合数据获得，是通过相似产物靶点相近的原理，进行一定的预测，用蛋白互作交叉验证进行预测的验证，可以分析疾病靶点富集度的显著性水平并对有效成分与目标靶点相关性进行评分[12]。参附强心丸由人参、附子(制)、桑白皮、葶苈子、猪苓、大黄组成。将6种成分提交给BATMAN-TCM，以score cutoff=20为筛选线，以P<0.05作为“药物-通路”结构构建的基准，得到参附强心丸的活性成分及靶点。

1.3 心衰相关靶点数据构建 本研究以“heart failure”为关键词检索GeneCards、OMIM、MalaCards、TTD数据库综合筛选心衰相关靶点。通过检索以上数据库，去重后获得心衰基因靶点，通过Uniprot数据库的UniprotID对应至基因简称gene symbol。

1.4 疾病-药物-成分-靶点网络的构建 将参附强心丸潜在靶点与心衰相关靶点均进行统一标准化命名(Uniprot数据库中的Gene name行标准化命名)，通过Excel表获得参附强心丸-心衰共同靶点，通过韦恩图展现。采用Cytoscape软件进行网络构建、可视化分析等。

1.5 药物-靶点相互作用网络构建 将参附强心丸-心衰共同靶点导入STRING蛋白质互作数据库，进行PPI分析，选择Required Confidence(combined score)>0.7为蛋白质与蛋白质相互作用关系的阈值，并下载相关tsv格式文件。使用Cytoscape软件对其进行网络图构建，根据Degree筛选出关键基因(Hub Gene)。

1.6 GO及KEGG通路富集分析 DAVID数据库是一个包括分析工具和整合生物学相关知识的数据库，可以从海量的基因与蛋白簇中提取有价值的生物学信息，该数据库可以对单个基因进行分析注释从而可以构建GO生物学过程(Biological Process，BP)、细胞组成(Cellular Components，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)结果。应用Cytoscape 软件中ClueGO插件关联的KEGG数据库对药物与疾病共同靶点进行KEGG通路富集分析，将结果以互作网络和饼状图呈现。

2 结果

2.1 参附强心丸活性成分筛选及靶点预测 在BATMAN-TCM数据库中，检索参附强心丸干预心衰的可能靶点，筛选Score cutoff≥20，P<0.05的活性成分。获得215个药物活性成分，对应靶基因2 257个(表1)。

表1 参附强心丸成分

续表1

续表1

2.2 心衰相关靶点数据构建及比对分析 以“heart failure”为关键词在GeneCards、OMIM、MalaCards、TTD数据库中查询，发现心衰的药物治疗性靶点有GeneCards(1 539)、OMIM(25)、MalaCards(51)、TTD(42)，筛选GeneCards中相关度score>0的基因(527)，结合Uniprot数据库确认并转换并删除重复靶点，最终得到582个。

2.3 疾病-药物-成分-靶点网络的构建 将参附强心丸靶点与心衰靶点导入Excel表进行分析，发现心衰与参附强心丸潜在靶点有242个重合，并于Venny2.1中绘制韦恩图(图1)。将结果导入Cytoscape软件构建药物-成分-疾病-靶点可视化网络(图2)。在网络中，节点表示化合物和靶标，连线表示化合物与靶标之间的相互作用。

注：蓝色圆形为参附强心丸靶点集合，黄色圆形为心衰靶点集合。图1 参附强心丸与心衰相关靶点韦恩图

注：绿色代表药物成分，蓝色代表参附强心丸-心衰共同靶标。图2 药物-成分-疾病-靶点网络图

2.4 靶点-靶点相互作用网络构建 将参附强心丸-心衰共同靶点导入String数据库中。利用Multiple proteins工具，限定物种为人，设定置信度阈值≥0.7，隐藏网络中不相关联的节点，对蛋白相互作用进行筛选。获取蛋白相互作用。共涉及241个节点，1 523条边，平均节度点为12.6，平均局部聚类系数为0.528。将全节点关系信息导出并导入Cytoscape，用节点的大小和颜色表示degree值的大小，节点越大对应的degree值越大，颜色由红变蓝对应的 degree值越大。用边的粗细表示Combine score值的大小，边越粗，Combine score值越大(图3)。利用cytoHubba插件根据Degree筛选出前20种PPI网络核心基因，并进行柱状图可视化(图4)。

图3 参附强心丸作用于心衰潜在靶点之间相互作用网络图

图4 PPI网络核心基因

2.5 GO及KEGG通路富集分析 通过DAVID软件对获得的242个参附强心丸-心衰共同靶点进行富集分析，富集分析采用超几何分布设计的算法，针对富集分析显著性P值的多重检验校正使用Benjamini-Hochberg校正方法。GO属于基因功能分类体系，有3个分支，即生物过程、分子功能、细胞组分，最终得到757个生物过程(Biological Process，BP)、81个细胞组成(Cellular Components，CC)、132个分子功能(Molecular Function，MF)。参附强心丸治疗心衰的靶点在生物过程中主要富集到炎症反应、调节血管收缩、腺苷酸环化酶调节G-蛋白偶联受体信号通路、ERK1和ERK2级联的正调控、衰老、蛋白激酶B信号的正向调控、血压的负调节、血管舒张的正调控、胞质钙离子浓度的正调控、血管收缩的正向调节、药物反应、心脏传导调节、血压调节、缺氧应答；细胞组成富集到细胞外基质、肌浆网、溶酶体、肌浆网膜等；分子功能中富集到钙调蛋白结合、细胞因子活性、肾上腺素结合、生长因子活性、酶结合、激素的活动、受体结合等。通过易汉博生物信息在线作图网站对GO富集分析前10结果进行可视化处理(图5)。其中，X轴代表富集因子(目标基因中属于这个分支的基因的数量/背景基因集中这个分支所有基因的数量)，Y轴代表名称，气泡面积大小代表目标基因集中属于这个分支的基因数量，气泡颜色代表富集显著性，即P值的大小。

图5 参附强心丸潜在靶点治疗心衰GO分析的气泡图(前10)

经ClueGO插件关联的KEGG数据库，共分析出60 条信号转导通路，经Bonferroni校正P值均<0.05。KEGG通路富集到cAMP信号通路、FoxO信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、肾素-血管紧张素系统、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、胰高糖素信号通路、脂肪细胞脂解的调控、肾素分泌、醛固酮的合成和分泌、胆固醇代谢、肥厚性心肌病、扩张型心肌病、流体剪切应力和动脉粥样硬化等(图6)。将得出的60条信号转导通路根据Kappa算法，进一步再聚类分为22组，为心肌细胞肾上腺素能信号、精氨酸生物合成、钙信号通路、胆固醇代谢、补体和凝血级联、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、TRP通道炎症介质调控、胰岛素抵抗、肾素分泌、肾素-血管紧张素系统及信号通路、cGMP-PKG信号通路等(图7)。

注：不同颜色的节点代表不同信号通路，节点越大代表调控作用越强，边代表不同信号通路的相互作用。图6 参附强心丸对心衰作用靶点的KEGG分析关系网络

图7 参附强心丸对心衰作用靶点的KEGG分析饼状图

3 讨论

参附强心丸用于治疗慢性心衰所引起的心悸、气短、胸闷喘促、面肢浮肿等症。该方作用于心衰的确切靶点尚不明确。网络药理学基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络系统综合观察药物对疾病网络的干预与影响，在中药已知化学成分，疾病已知靶点的基础上，揭示“药物-基因-疾病”共模关联，体现了中医药的整体观与系统性，为中医药治疗多因素导致的复杂疾病提供了新的途径[13]。这有助于将中医从经验医学向循证医学体系转化，降低重要新药开发及研究的风险，辅助中药新药的二次开发，加快中医药的发展[14-16]。

前期研究显示参附强心丸可以通过降低心肾组织肾素原受体(PRRmRNA)表达，抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路蛋白激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、P38磷酸化[17]，上调心肾综合征大鼠Bcl-2表达，抑制LC3b、Bax表达，降低心肾组织凋亡[18-19]。参附强心丸可能抑制心衰患者炎性细胞因子[20]、下调血管紧张素Ⅱ和脑钠素[21]，联合西药可显著降低机体氧化应激损伤，改善血管内皮功能，抑制炎性反应[22]，与本研究预测的参附强心丸调控心衰的通路基本一致，表明预测的潜在活性成分与靶点具有一定的可靠性。

研究结果显示参附强心丸的多个化合物可作用于同一个靶点，一个化合物也可以调控多个靶点，同一靶点可参与不同的信号通路及生物学过程。通过PPI网络可以发现参附强心丸作用于心衰的核心基因IL-6、TNF、CRP均参与炎症反应，在心衰的进展中起关键作用[23]。KEGG信号通路主要富集在糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、肾素分泌、cGMP-PKG信号通路。有研究表明AGEs及其受体在心血管疾病的发病机制中起着核心作用，导致糖尿病患者高致残率和高死亡率[24]。血浆肾素增多激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，使血浆血管紧张素Ⅱ和醛固酮分泌增多。心血管并发症的累积导致全身炎症、氧化应激和冠状动脉微血管内皮炎症的增加，最终导致环磷酸鸟苷酸(cGMP)通过多种途径降解，从而降低蛋白激酶G(PKG)的活性。该途径可能是治疗心衰的潜在靶点[25]。

综上所述，参附强心丸治疗心衰具有“多成分、多靶点、多途径”的作用特点，本研究为今后验证该药具体作用靶点和信号通路奠定了良好的理论基础。由于目前对参附强心丸治疗心衰的机制研究尚处于较浅阶段，且网络药理学研究是基于生物信息学及大量数据库计算得出的结果[26]，后续将在此基础上进行体内外实验验证，从而明确参附强心丸治疗心衰的作用机制。