黄芪果糖制剂对D-半乳糖衰老模型小鼠肌肉与骨骼的影响

梁美婷， 王可欣， 吕思敏， 崔 燎,2， 许碧莲,2*， 吴 铁,2*

(1.广东医科大学药理学教研室，广东 湛江 524023；2.广东天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江 524023)

骨质疏松症已成为全球性的公共健康问题和前沿研究难题。骨质疏松与肌肉、骨骼密切相关，老年人骨骼肌肉系统的衰退会造成肌肉减少、骨质减少，进而引起骨脆性增大，最终导致老年人生活质量下降[1]。但是这种骨质疏松与肌肉之间的联系尚未得到广泛接受，如何解决老年性肌肉减少症所带来的骨脆性风险是一个不可忽视的问题，黄芪含有多糖、黄酮、苷类和微量元素等多种成分[2]。现代药理实验证实[3]，黄芪对骨质疏松症有较好的预防和治疗效果。除此之外，黄芪还具有增强肌肉收缩力，提高耐力和促进疲劳消除等保护骨骼肌的作用[4]。果糖升糖指数低，可以不经过胰岛素途径迅速进入细胞组织，有利于老年人肌肉组织和骨骼组织的能量需求，有助于蛋白质的合成代谢，黄芪与果糖组成的合剂，应该具有增强肌肉和骨骼的蛋白质合成功能、对老年人预防肌肉减少与骨质疏松具有良好的作用，本研究建立D-半乳糖小鼠的衰老模型，探讨黄芪果糖制剂是否可通过作用于骨骼-肌肉系统，有效地预防肌减少所带来的骨质疏松风险，对黄芪果糖制剂在防治老年性肌肉减少症和骨质疏松症的开发应用提供一个参考依据。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级白色昆明雄性小鼠50只，17周龄，体质量35～40 g，购于南方医科大学动物中心，实验动物使用许可证号SYXK(粤)2015-0147。在普通级动物饲养房内饲养，动物于实验前适应环境1周，自由摄食饮水，每笼10只。

1.2 药物 黄芪(湖北金贵中药饮片有限公司，批号A171102，产地甘肃)；甘草(广州市怡康药业有限公司，批号C170702，产地甘肃)。D-半乳糖(北京索莱宝科技有限公司,批号923C057)；生理盐水(石家庄四药有限公司，批号1603032103)；果糖(广东永青生物科技有限公司，批号16110401)；骨化三醇(瑞士Roche公司，批号B2166B05)。

1.3 仪器 AE240电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Micro-CT viva CT40仪(瑞士Scanco公司)；858 Mini Bionix型材料测试系统(美国Mst公司)；KQ-250DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Spring实验室纯水仪(广州誉维生物科技仪器有限公司)；JB-P5生物组织包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)；荧光显微镜普通光学显微镜(日本Nikon公司)。

1.4 实验方法 取上述小鼠按随机区组法，将动物分别按体质量区分为若干个区组，然后将各区组通过随机函数Rand平均分配到5组，每组10只，具体为(1)正常组，小鼠按0.1 mL/10 g灌胃给予生理盐水，并背部注射生理盐水；(2)模型组，每天背部皮下注射150 mg/kgD-半乳糖(用生理盐水溶解D-半乳糖，浓度为0.083 mol/L)，连续12周，造成衰老模型，并按0.1 mL/10 g灌胃给予生理盐水[5]；(3)骨化三醇干预组，造模方法同模型组，然后按0.076 μg/kg灌胃骨化三醇溶液(骨化三醇混悬液配制方法为0.25 μg/粒骨化三醇软胶囊，加2 mL吐温80，再加入30 mL蒸馏水，最后超声提取0.5 h，避光保存)；(4)果糖干预组，造模方法同模型组，然后小鼠按每天1.2 g/kg灌胃给予果糖溶液(果糖溶液配制方法为称取12 g果糖，加入煮沸后放凉的双蒸水搅拌溶解，定容至100 mL)；(5)黄芪果糖制剂干预组，造模方法同模型组，然后小鼠按每天10 g/kg灌胃黄芪果糖制剂溶液(用黄芪、甘草，按3∶1比例用水提取3次，浓缩至含黄芪生药量为1 g/mL，最后加入的果糖质量分数为0.12 g/mL，混匀)。所有小鼠于适应性喂养1周后开始实验，连续给药12周。实验过程中每天观察小鼠进食、饮水、活动情况等变化并记录，7 d称体质量1次，并按体质量变化调整给药量。实验结束时，采用眼球取血处死小鼠。取双侧股骨做Micro-CT扫描以及生物力学三点弯曲实验，取腓肠肌称定质量、HE染色并进行组织学观察。

1.5 观察指标及测定方法

1.5.1 小鼠体质量 每周称小鼠体质量1次，实验第12周在实验结束前停止供应饲料12 h，称重，作为最终的体质量。

1.5.2 小鼠腓肠肌 实验结束时小鼠处死，解剖取出完整的腓肠肌，精确称量湿重，计算脏器系数，脏器系数计算公式是脏器系数=(器官湿重/体质量)×100%[6]。HE染色为取小鼠腓肠肌，横向切取0.5 cm3大小的腓肠肌组织，浸入4%多聚甲醛中固定12 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋块用于制作石蜡切片。HE 染色后，采用LEICA MP30荧光显微镜及显维照相机采集图片并进行组织学观察。

1.5.3 小鼠股骨的生物力学分析 测试时，将-80 ℃保存的股骨室温解冻，用酒精-生理盐水复湿，进行试验。实验时，用858 Mini Bionix型材料测试系统分析右侧股骨的三点弯曲实的生物力学性能。把小鼠股骨放在MTS试验机上，加载速度为0.155 mm/s，跨距5 mm。由载荷、桡度换算并绘制应力-应变曲线，从曲线上读取及根据公式计算相应的指标: 最大载荷、断裂载荷、弹性载荷、刚度等[7]。

1.5.4 Micro-CT对小鼠股骨的分析 将小鼠股骨除尽肌肉和附着组织，放入Micro-CT仪，对股骨干骺端进行X射线扫描。viva CT40选择扫描参数: 图像矩阵为2 048×2 048，整合时间为200 ms，能量/强度为70 kVp，114 μA，8 W，以0°旋转进行扫描。扫描完成后，选取距生长板远端1.0 mm、层厚2.0 mm的骨组织为松质骨感兴趣区域(ROI)行三维重建，以最低阈值为150提取图像信息。定量分析使用其软件(Scanco Medical AG)，分析参数。参数如下：连接密度(connectivity density, Conn.D.)、结构模型指数(structure model index,SMI)、骨密度(bone mineral density, BMD)、骨体积分数(bone volume/tissue volume, BV/TV)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp)[7]。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量的变化 各组小鼠体质量的变化见表1，可见开始用药前，各组间小鼠体质量差异无统计学意义。在实验结束时，各组小鼠体质量均有增加，但各组间小鼠体质量差异仍无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组小鼠体质量的变化

2.2 各组小鼠腓肠肌质量的变化 各组小鼠腓肠肌质量的变化见表2，可见与正常组比较，模型组的腓肠肌质量和腓肠肌重/体质量比稍有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，说明D-半乳糖对雄性小鼠腓肠肌质量影响不大。与模型组比较，骨化三醇干预组的腓肠肌质量和腓肠肌重/体质量比差异亦无统计学意义(P>0.05)，说明骨化三醇不影响D-半乳糖雄性小鼠腓肠肌的质量；与模型组比较，果糖干预组的腓肠肌质量和腓肠肌重/体质量比分别增加13.29%(P<0.05)和14.06%(P<0.05)，说明12%果糖可以增加D-半乳糖雄性小鼠腓肠肌的质量；而黄芪果糖干预组的腓肠肌质量和腓肠肌重/体质量比分别增加18.50%(P<0.05)和11.72%(P<0.05)，说明黄芪果糖制剂可以明显增加D-半乳糖雄性小鼠腓肠肌的质量。

表2 各组小鼠腓肠肌肌重和腓肠肌/体质量比的变化

2.3 各组小鼠腓肠肌HE染色及结果观察 各组小鼠腓肠肌HE染色结果见图1，由此可见，正常组肌细胞结构均一，细胞间隙较小。模型组与正常对照组比较，肌细胞大小不一，形态不规整，细胞间隙增宽，肌细胞圆形化，有肌肉减少的明显形态学改变。骨化三醇组与正常组无太大差异。与模型组比较，果糖干预组、黄芪果糖干预组的肌细胞形态规则，结构清晰，连接有序且紧凑，没有肌肉减少的形态学变化，与正常组相比较接近，提示应用12%果糖、黄芪果糖制剂可以预防D-半乳糖衰老小鼠腓肠肌肌肉减少的形态学变化。

注：A为正常组, B为模型组, C为骨化三醇干预组, D为果糖干预组, E为黄芪果糖干预组。图1 各组小鼠腓肠肌横切面HE图(5 μm, ×200)

2.4 各组小鼠股骨生物力学指标的变化 各组小鼠股骨生物力学指标的变化见表3，可见与正常组比较，模型组小鼠股骨生物力学参数弹性载荷、最大载荷、断裂载荷有下降趋势，但差别均未达统计学差异(P>0.05)，提示D-半乳糖对雄性小鼠股骨生物力学性能影响不大。与模型组比较，骨化三醇干预组的弹性载荷、最大载荷、断裂载荷和刚性系数分别增加58.84%(P<0.05)、53.27%(P<0.05)、36.02%(P<0.05)和36.10%(P<0.05)，提示骨化三醇可明显增加D-半乳糖雄性衰老小鼠的股骨生物力学性能。果糖干预组的弹性载荷、最大载荷、断裂载荷有上升趋势，但差别均未达统计学差异(P>0.05)，提示12%果糖对D-半乳糖对雄性小鼠股骨生物力学性能影响不大。黄芪果糖干预组与模型组比较，其弹性载荷、最大载荷和断裂载荷分别增加37.61%(P<0.05)、30.90%(P<0.05)和27.03%(P<0.05)，提示黄芪果糖制剂可明显增加D-半乳糖雄性衰老小鼠的股骨生物力学性能。

表3 各组小鼠骨生物力学性能的变化

2.5 各组小鼠股骨远端松质骨Micro-CT二维图和三维图结果观察 各组小鼠股骨远端松质骨 Micro-CT 三维图和二维图结果见图2～3，图2为各组三维TH图，反映骨小梁的厚度分布情况，从绿到红，反映了骨从薄到厚；图3为各组小鼠股骨远端松质骨Micro-CT的二维图，可见骨髓腔内骨小梁数量，可见正常组小鼠的股骨骨小梁较粗，间隙较小，数目较多，连续性较好；而模型组小鼠的股骨则出现了骨小梁断裂，变短，网状结构退化，而且在中央还出现较大的间隙。骨化三醇干预组小鼠股骨的骨小梁分布排列均匀有序，紧密，且间隙较小，连续性较好，与对照组无显著性差异。果糖干预组小鼠的股骨出现了骨小梁断裂，变短，网状结构退化，而且在中央还出现较大的间隙，与模型组无显著性差异。黄芪果糖干预组小鼠股骨的骨小梁分布排列均匀有序，紧密，且间隙较小，连续性较好，与正常对照组无显著性差异。结果表明，雄性小鼠给予D-半乳糖12周后，小鼠股骨的骨量减少，骨微观结构受到破坏，与雄性小鼠骨质疏松表现一致，可建立骨质疏松动物模型，骨化三醇和黄芪果糖制剂均可增加D-半乳糖雄性小鼠股骨的骨量，使骨微观结构得到改善，对该模型的骨质疏松表现有预防作用。

注：A为正常组，B为模型组，C为骨化三醇干预组，D为果糖干预组，E为黄芪果糖干预组。图2 各组小鼠股骨Micro-CT的与ROI区三维重建图(TH)

注：A为正常组，B为模型组，C为骨化三醇干预组，D为果糖干预组，E为黄芪果糖干预组。图3 各组小鼠股骨Micro-CT的二维图

2.6 各组小鼠股骨Micro-CT扫描形态计量指标的变化 各组小鼠股骨Micro-CT扫描指标的变化见表4～5，可见与正常对照组比较，模型组股骨Micro-CT指标的Conn.D.、BMD、BV/TV和Tb.N分别降低了68.08%(P<0.05)、71.89%(P<0.05)、61.54%(P<0.05)和58.87%(P<0.05)，SMI增加了39.34%(P<0.05)，提示D-半乳糖可以降低正常生长雄性小鼠股骨的骨密度，骨小梁由杆状结构转变为板状结构，骨微结构受到破坏。与模型组比较，骨化三醇干预组股骨Micro-CT指标的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th分别增加了439.48%(P<0.05)、256.36%(P<0.05)、152.63%(P<0.05)和37.50%(P<0.05)，SMI降低了30.98%(P<0.05)，提示骨化三醇可以改善D-半乳糖雄性小鼠骨丢失的情况，骨小梁由板状结构转变为杆状结构，改善骨小梁的微观结构；果糖干预组的Conn.D.、BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th有增加的趋势，SMI和Tb.Sp有降低的趋势，但差别均无统计学差异(P>0.05)，提示12%果糖对D-半乳糖雄性小鼠骨丢失的情况改善不明显，亦不能改善骨小梁的微观结构；黄芪果糖制剂干预组的Conn.D.、BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th分别增加了207.97%(P<0.05)、329.56%(P<0.05)、224.45%(P<0.05)、166.32%(P<0.05)和26.79%(P<0.05)，SMI降低了38.04%(P<0.05)，提示黄芪果糖制剂可以明显改善D-半乳糖雄性小鼠骨丢失的情况，骨小梁由板状结构转变为杆状结构，改善骨小梁的微观结构。

表4 各组小鼠股骨Micro-CT扫描参数的变化

表5 各组小鼠股骨Micro-CT扫描参数的变化

3 讨论

3.1D-半乳糖对雄性小鼠的骨骼与肌肉的影响 模型组小鼠体腓肠肌质量体质量比稍有下降趋势，同时石蜡切片HE染色结果可见模型组肌细胞有减少和形态的改变。D-半乳糖对小鼠股骨生物力学性能影响不大，但通过Micro-CT形态学观察，发现小鼠股骨出现了骨小梁断裂，变短，网状结构退化，而且在中央还出现较大的间隙；模型组Conn.D.、BMD、BV/TV和Tb.N降低了，SMI增加，提示了D-半乳糖可造成雄性小鼠骨质疏松和肌肉减少。主要原因与D-半乳糖代谢过程中产生过多的自由基，后者能诱导脂质体氧化，进而损伤细胞有关。

3.2 骨化三醇对D-半乳糖对雄性小鼠骨骼与肌肉的影响 与模型组比较，骨化三醇组的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均增加，SMI降低，断裂载荷、弹性载荷、最大载荷和刚性系数均增加，说明骨化三醇可增加D-半乳糖雄性小鼠的股骨生物力学性能，并且在微观结构上改善D-半乳糖雄性衰老小鼠骨小梁损伤与骨量丢失的情况。骨化三醇在临床上治疗骨质疏松已经有大量的研究报道，其对骨骼中的钙磷平衡方面发挥重要调节作用，维持了骨量的平衡，阻止骨质疏松的出现[8]。但骨化三醇并不能同时预防老年骨质疏松与预防老年肌肉减少症的发生。

3.3 果糖对雄性小鼠骨骼与肌肉的影响 与模型组比较，果糖组对D-半乳糖小鼠的骨生物力学性能、Micro-CT指标等有改善作用；12%果糖组的腓肠肌质量和腓肠肌重/体质量均增加，同时HE染色可见12%果糖组的肌细胞形态规则且饱满，连接紧凑有序，可以增加D-半乳糖衰老小鼠的腓肠肌肌重，从而预防老年肌肉减少。果糖增加腓肠肌质量的原因还不清楚，可能与果糖进入肠道和肌肉不依赖于胰岛素有关，可直接进入肠道被人体消化利用，在肝脏中的代谢速度非常快[9]。除此以外，果糖和葡萄糖在促进肠道果糖吸收、肝脏能量吸收和糖原合成方面具有协同作用，可增加肌肉能量供应[10-11]。

3.4 黄芪果糖制剂对雄性小鼠骨骼与肌肉的影响 与模型组比较，黄芪果糖组增加小鼠腓肠肌质量和腓肠肌指数，通过HE染色观察，黄芪果糖组的腓肠肌形态学变化与正常组比较较接近，说明黄芪果糖制剂可以预防D-半乳糖导致的肌肉减少。小鼠股骨生物力学指标检测证明，与模型组比较，其弹性载荷、最大载荷和断裂载荷均增加，提示黄芪果糖制剂可增强小鼠的股骨生物力学性能。通过Micro-CT对小鼠股骨远端松质骨进行三维和二维检测结果可见，与模型组比较，黄芪果糖干预组小鼠股骨的骨小梁分布排列均匀有序，紧密，且间隙较小，连续性较好，与正常对照组无显著性差异。提示黄芪果糖制剂可增加D-半乳糖雄性小鼠股骨的骨量，使骨微观结构得到改善。通过Micro-CT对小鼠股骨扫描形态计量指标的比较，黄芪果糖制剂干预组Conn.D.、BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均增加，SMI则降低，结果证明黄芪果糖可以改善D-半乳糖雄性小鼠骨小梁的微观结构。黄芪是一味具有补气益气作用的中药，主要含黄芪皂苷、黄芪多糖、多种氨基酸等，有扩张血管、抗自由基损伤、保护心肌等多种药理作用，是临床应用较为广泛的中药[12-15]。有研究者观察了黄芪联合局部热敷对武警官兵集训期间机体损伤的保护作用，证明了黄芪联合热敷能通过调节氧化与抗氧化平衡来抑制长时间运动中所导致的肌肉损伤[16]。研究结果表明，黄芪对肌肉损伤有较好的保护作用；本课题组早期通过研究证明了黄芪对骨质疏松有很好的延缓作用，可明显增加骨形成，减少骨丢失，与性激素相类似，可以促进胶原蛋白的合成，促进骨细胞对类骨质的分泌，对破骨细胞有抑制作用，并具有促进骨的形成[17-20]。本实验研究表明黄芪果糖制剂对骨骼与肌肉均产生有益的作用，这与果糖是一种特殊的能量补充剂且不易升高血糖有着密切关系，果糖可以不通过胰岛素途径直接进入肌肉，直接转化为肌糖原，及时补充了肌肉组织细胞因能量缺乏导致的代谢障碍，果糖也可以直接进入骨骼细胞，补充细胞的能量，与黄芪配合可以更好地促进受伤肌肉组织与骨骼组织的修复，同时预防肌肉丢失及骨质疏松的发生。因此黄芪和果糖组成的复方合剂，共同发挥了壮骨强肌的作用，是一种可预防老年肌肉减少症与骨质疏松症的创新复方制剂。

4 结论

本实验发现，黄芪果糖制剂可改善该模型小鼠股骨的微观结构并有助于预防肌肉的衰老和丢失，为肌肉减少性骨质疏松症提供一个新的防治方案，且具有较好的创新性和潜在应用转化价值，但单纯的 2.5%D-半乳糖虽能在几个月内造成明显的骨量丢失但是不能造成明显的肌肉减少现象，肌肉质量减少只有下降的趋势。这是本次实验的不足之处，考虑加大D-半乳糖的剂量是肌肉衰老减少的现象更加明显。