不同生长年份、生境人参判别方法的研究进展

郭 静， 陈丹青， 王士祥

(上海上药神象健康药业有限公司，上海 200336)

人参是驰名中外的名贵药材，具有保肝[1]、调节免疫[2]、抗疲劳[3-5]、抗糖尿病[6]、抗肿瘤[7-8]、抗抑郁[9]、治疗心脑血管[10-12]和神经系统疾病[13-15]的功效。根据人参生长环境和栽培方式的不同，可以分为园参、林下山参、野山参和野生人参4类。自然传播、生长于深山密林的原生态人参，称为野生人参。野生人参是人参中的极品，产量极少，资源濒临枯竭，且不允许私自采挖和买卖，因此市场上以园参、林下山参和野山参为主。其中人工栽培的人参俗称“园参”；播种在山林野生状态下自然生长的人参称“林下山参”，习称“籽海”；播种后自然生长于深山密林15年以上的人参，可称为野山参[16]。野山参价值不菲，经常单支售价过万，林下山参价格从每公斤几千到十几万元不等，而园参的价格仅为每公斤数百至千元。参龄是影响人参品质的重要因素，也是野山参分等定价的重要依据。园参的商品年限多在4～5年，一般不超过6年，林下山参的商品年限多在10年以上，野山参的商品年限多在20年左右。目前不同生境的人参及其生长年份的判别仍以经验鉴别为主，芦、艼、体、纹、须、皮、点等方面的外观特征是其主要的鉴别要点[17-18]，但该方法过于主观，评价结果不具备可重复性，对鉴定者的鉴别经验也有极高的要求。近年来得益于现代科技的快速发展，与人参判别相关的技术方法层出不穷，但尚无文献对其进行系统的整理，本文现就园参、林下山参、野山参及其生长年份的判别方法进行综述，以期为市售人参的质量评价和年份判别提供参考。

1 不同生境人参的年份判别

参龄和生长环境对人参化学成分和内在品质有着极大的影响，而目前《中国药典》仅以人参皂苷Rg1、Re和Rb1含量作为检查指标，方法过于简单，不能凸显出不同生长年份人参的成分差异，也无法用于园参、林下山参及野山参等不同生境人参的科学判别。本文对上述3种常见人参的年份判别方法进行了整理，但由于目前尚无野山参年份判别的针对性报道，而常与园参、林下山参一起作为试验对象进行分类识别，故后续仅对园参的年份判别、林下山参的年份判别以及园参、林下山参、野山参的分类判别方法进行归纳。

1.1 园参的年份判别

1.1.1 显微鉴别 通过观察人参的显微结构可以快速鉴别人参真伪，而根据显微特征物的变化还可以初步比较人参年份的长短。郑秀茜等[19]采用显微定量法，以人参的草酸钙簇晶为显微特征物，根据不同年限不同部位特征物含量及形态上的差异对1～7年生园参进行了鉴别，发现芦头内的草酸钙簇晶含量明显高于其他部位，且随着生长年限的增加，全参、芦头、主根、侧根、须根中草酸钙簇晶的含量明显上升且体积逐渐增大。而随着年限的增长，2～5年生石柱参须根中草酸钙簇晶的含量呈逐渐降低的趋势。这表明基于特征物的形态和含量变化，显微鉴别法可用于样本量较少时同种园参样本间年限长短的快速比较，但尚不能对单个园参样本的品种及生长年限进行判别或预测。

1.1.2 成分鉴别 基于不同生长年限园参中多种成分含量的差异，结合现代检测分析技术，可以较为准确的判别和预测园参年份。这些检测分析技术主要分为光谱法、色谱法、质谱法及色谱-质谱联用等方法，其中光谱法又包括红外光谱法和紫外光谱法，而色谱法则以液相色谱法为主。

1.1.2.1 光谱法 光谱法分红外光谱法和紫外光谱法。其中红外光谱法高效、快速，可用于人参的定性和定量分析，还可以实现对人参品种和年份的初步判别。Kwon等[20]比较了4个品种的1、2、3年生园参叶的红外光谱，并将其数据进行量化，发现不同品种和生长年份的园参叶在多糖、酰胺等代谢成分的组成和含量上均存在明显差异，并基于此差异建立了PLS-DA判别模型，可以有效的判别和预测园参叶的生长年份，准确率达94.8%。紫外光谱法以紫外分光光度法为主，在园参总皂苷含量的分析测定中较为常用。麻锐等[21]利用紫外分光光度法测定了1～5年生园参的总皂苷含量，对比发现园参总皂苷含量随生长年限的增加而显著增加，其中5年生园参是1年生园参的近4倍。

1.1.2.2 液相色谱法 液相色谱法是色谱法中应用最为普遍的一种方法，在园参的年份判别研究中多用于分析皂苷类成分含量的整体变化趋势。余江锋等[22]采用HPLC技术测定了吉林抚松3～9年生园参中8种人参皂苷的含量，结果发现人参皂苷Rg1含量随生长年限的增长而逐渐增加，而8种人参皂苷的总含量与人参皂苷Rg1含量的比值，及人参皂苷Re、Rb1、Rc、Rd含量与人参皂苷Rg1含量的比值均呈逐年下降趋势(P<0.01)。麻锐等[21]通过HPLC法分析了1～5年生园参中6种常见人参皂苷的含量，发现皂苷含量整体呈现逐年递增趋势，其中人参皂苷Rb1、Rb2含量随年限显著递增，Rg1、Rc、Rd呈现逐年缓增趋势，而Re含量在第3年最高，随后趋于平缓。

1.1.2.3 质谱法 质谱是一种测量离子荷质比的分析方法，具备高特异性、高灵敏度和广适性，可以在一次分析中提供丰富的结构信息。Bai等[23]采用MALDI-TOF-MSI和MALDI-TOF-MS/MS技术建立了一种有效探索人参皂苷分布规律的方法，并对2、4、6年生园参根进行了定位研究，发现人参皂苷类成分主要集中在形成层以外的韧皮部和皮层中，且以m/z1 117(Rb2/Rc)和m/z1 147(Rb1)处质谱峰所对应的人参皂苷在园参中的含量高于其他成分(P<0.01)，二者峰强度之比可以用于园参和西洋参的区分，以及不同年份园参的鉴别。

1.1.2.4 液相色谱-质谱联用 液相色谱-质谱联用技术具有广适性好、分离能力强、检测限低、灵敏度高等优点，是植物代谢组学中最重要的分离和鉴定的分析方法之一，在园参年份判别的研究中应用也极为广泛。Xiu等[24]采用HPLC-MRM/MS技术对不同生长年份园参中14种皂苷类成分进行定量研究，并基于人参皂苷Rg1、Rb1、Rb2、Rc、20(S)-Rf、20(S)-Rh1及Rb3在3年生和5年生园参中含量的显著差异，建立了PLS-DA模型，准确的判别了园参的年份。张博等[25]采用RRLC-Q-TOF-MS技术发现，3年生和5年生园参中人参皂苷Rb1、Rh4、Rk2等11种成分存在显著性差异，其中人参皂苷 Rb1、Rk2和 Rh4等成分含量呈现随生长年限增长而增加的趋势，人参皂苷Rg1、Rf、Rh1、Rb1等10种成分在不同产地间存在显著性差异，而基于上述差异可以为人参生长年限和产地的判断提供一定的信息。Huang等[26]采用UHPLC-QTOF/MS技术对2～6年生园参的整体代谢物质进行研究，结果发现基于35种与糖类、有机酸、脂类、氨基酸和皂苷相关的成分含量存在显著差异。糖类成分的积累与园参生长年限呈显著正相关(R2>0.9)；3～5年生园参中氨基酸和皂苷类成分含量高于2、6年生园参，而丙二酰人参皂苷Rd和丙二酰人参皂苷Rc/Rb2含量却随着生长年限的增加呈逐渐减少趋势；3～5年生园参中以氨基酸和有机酸含量差异较为明显。此外，该研究发现了1种2年生园参的缺失性成分，该成分有可能作为鉴别2年生园参的依据。还建立了差异代谢物峰面积总和与园参生长年限之间的回归方程，用以预测和判别3～6年生园参样本的生长年限，准确率高达91.7%。

1.1.2.5 其他方法 双向电泳技术可以实现对不同年份园参蛋白质表达差异的研究。麻锐等[27]利用双向电泳技术分离了1～5年生园参根蛋白，重点分析了3年生和5年生根之间的蛋白质组学差异，结果发现在园参生长发育的过程中存在过氧化氢酶、果胶酯酶等多种蛋白的差异性表达，此外，新颖的电子鼻技术近年来在园参的年份判别研究中也有所应用。Cui等[28]同时采用电子鼻技术和气相色谱-质谱联用技术对2～5年生园参中挥发性成分的种类和含量进行了比较，基于差异性成分建立了可以有效区分园参生长年限的判别模型和树状图，还通过分析实验结果初步发现，电子鼻技术较气相色谱-质谱联用技术能更好的应用于园参年份的判别研究。

1.2 林下山参的年份判别

1.2.1 显微鉴别 基于对林下山参显微结构及其特征物的观察，可以快速比较林下山参的生长年份。Liang等[29]从1～6年生二马牙林下山参主根石蜡切片中观测到了与其年份相对应的清晰年轮，然而当参龄超过6年时年轮不再清晰，不能精确地反映林下山参生长年限。

1.2.2 成分鉴别 林下山参具有和野山参相似的品质和成分，研究表明光谱法、液相色谱法、质谱法、液相色谱-质谱联用及分子鉴别等方法适用于不同年限林下山参成分的分析，可以从多水平多角度实现林下山参年份的直接或间接判别。

1.2.2.1 光谱法 光谱法在林下山参年份判别研究中的应用以红外光谱法为主，基于组织横切面红外吸收光谱的差异，可以真正实现林下山参年份的无损识别。而研究表明不同生长年限的林下山参同一扫描部位的近红外吸收光谱有所不同，当年份一致而扫描部位不同时其吸收光谱也不一样。卜海博等[30]发现林下山参主根上部为无损识别和生长年限判别扫描的最佳部位，并通过扫描采集了12、15年生林下山参的近红外光谱，在对光谱进行预处理后结合主成分分析-马氏距离法，建立了12、15年生林下山参的无损识别模型，并实现了准确分类。紫外光谱法则主要用于林下山参中总皂苷、淀粉、糖类成分含量的测定。Pan等[31]通过测定不同生长年限林下山参和园参的供试品溶液在580 nm处的紫外吸收，发现林下山参中淀粉的量不如园参，且林下山参的生长年限越长，所含淀粉量越低。

1.2.2.2 液相色谱法 液相色谱法在林下山参的化学成分分析中也较为常用，多用于皂苷类成分的定量检测，再通过对测定结果的分析可以初步得到成分含量随年份的变化规律。余江锋等[22]采用HPLC法测定了8～18年林下山参中人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 8种成分的含量，发现人参皂苷Rb1、Rb2的含量及8种皂苷的总量随生长年限的增长而明显增加，人参皂苷Rg1含量随生长年限的增长先增加后减少，在13～14年时达到峰值，人参皂苷Re在15年时达到峰值，并提出可以根据人参皂苷Rg1含量和人参皂苷Re、Rb1与人参皂苷Rg1的含量比值初步推测其生长年限。杨文志等[32]通过比较林下山参和园参的HPLC图谱发现，林下山参中人参皂苷Rb1的含量明显高于园参(P<0.01)，且随着参龄的增长而增加，而Rg1和Re则表现为下降趋势。

1.2.2.3 质谱法 质谱分析可与蛋白质组学技术结合，用于分析不同生长年限林下山参中的差异性表达蛋白。Ma等[33]基于蛋白组学技术结合MALDI-TOF/TOF MS分析，发现林下山参中192个差异蛋白的表达量随年份增长而增加，并推测与能量代谢、人参皂苷生物合成和应激反应相关。其结果还表明随着生长年限的增加，林下山参的外观、蛋白表达、皂苷合成能力等与野山参相似度越高，初步证明了林下山参可以作为野山参替代资源的可能性。

1.2.2.4 液相色谱-质谱联用 与园参一样，液质联用技术在林下山参的年份判别研究中应用也极为广泛，不仅可以对整体代谢物进行分析，最大程度的获取差异性成分，还能结合统计学方法建立有效的年份判别模型，是目前国内外最常用的前沿分析方法。Chang等[34]通过UHPLC/QTOF-MS技术分析了6～18年生林下山参叶中的成分，发现基于人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd、Re、F2等成分含量的显著差异(P<0.05)，不同年份林下山参叶可以被明确划分为6～10、11～13、14～18年 3个年份区间，其中人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd等8种成分在6～10年内含量较高，人参皂苷Re、三七皂苷Fe、三七皂苷Fd在11～13年内含量较高，人参皂苷F2则在14～18年内含量较高。进一步研究发现，6～10年生参叶主要在人参皂苷Re、三七皂苷R1等10种成分含量上存在明显差异，11～13年生参叶中人参皂苷Rc、Rb2、Rd等8种成分含量差异显著，14～18年生参叶中人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd等10种成分含量存在明显差异，根据这些差异可以很好的判别和预测各林下山参样本的生长年份，为林下山参生长年限的无损判别提供了重要参考。常相伟等[35]基于UPLC-Q-TOF/MS技术还发现11～15年生林下山参芦头中的代谢物组成也存在明显差异，其中包含了290个与年份相关的差异代谢物，基于这些代谢物在含量上的显著差异，再通过PCA和OPLS-DA等统计学方法建立了年份判别模型，有效的区分了不同年份的林下山参样本，为林下山参生长年限的判别又提供了一种新的方法。Zhu等[36]采用UPLC-QTOF/MS技术从林下山参根部筛选出了棕榈烯酸、24-羟基齐墩果酸、人参皂苷Re1、Re2、Rs1和丙二酰人参皂苷 Rb2、Rb1异构体7个与年份相关的差异代谢物，建立了OPLS-DA模型，成功将12年生和20年生林下山参进行了区分。

1.2.3 分子鉴别 林下山参在分子水平上的年限刻录主要体现在端粒长度的变化上。黄璐琦课题组基于人参端粒和端粒酶的分子机制，探索了不同产地和品种的林下山参端粒长度与年限的相关性。其中Liang等[29]首先发现，二马牙林下山参芦头下约1厘米主根处的端粒长度是最好的年龄指标，该长度随着林下山参年限的增长逐渐延长，可用于2～8年生林下山参的年份判别。程春松[37]发现1～14年生石柱参的平均端粒长度随着年限的增长而缩短，表明林下山参端粒长度的变化趋势受到品种的影响。此外，该研究还基于端粒分子技术建立了以林下山参生长年限和端粒长度为自变量的数学模型，并在年份刻度明显、生长环境相似的维管植物赤芍中得以技术重现，证明了平均端粒的缩短可以作为年份鉴定的指标。该课题组研究从分子水平上提供了一种可操作、可量化、科学准确而又近乎无损识别的林下山参年份判别技术，对于林下山参内在质量的科学把控具有重要意义。

此外，荆礼等[38]通过比较多种内参基因表达量的稳定性，发现延伸因子1-α及V型质子ATP酶亚基B1在各年份林下山参中表达量最稳定，从而提出可以将其作为矫正实时荧光定量PCR数据的内参基因，有助于提高基因表达分析的准确性，也为林下山参分子水平上的年份鉴别研究奠定了基础。

2 园参、林下山参和野山参的判别

2.1 显微鉴别 显微鉴别是一种基于组织切片或粉末的鉴别方法，这种方法以观察细胞中后含物特征、数量为主。研究表明，园参、林下山参和野山参的显微特征有所不同。徐世义等[39]发现，园参、林下山参和野山参主根的木质部和须根的横切面特征存在差别，主要表现为主根横切面木质部比例随参龄增长而有所增加，主根簇晶、木质部导管的数量及辐射状排列的连续程度均随生长年限的增加呈显著增加趋势，而淀粉粒的数量则随年份增加而显著减少。

此外，X射线相衬显微成像技术具有无损、原位、三维定量等优点，文献[40]报道可以用于园参、野山参等的三维显微结构的定量分析，并同时掌握草酸钙簇晶的大小和位置分布信息，在物种鉴定和年龄鉴定等方面具有重要意义。

2.2 红外光谱鉴别 红外光谱具有高效、快速、可进行无损检测等优点，也可用于园参、林下山参和野山参的鉴别。Liu等[41]发现，在1 200～1 000 cm-1范围内，野山参和林下山参于1 049 cm-1处有最强峰，而园参的最强峰则在1 017 cm-1处；野山参和林下山参在1 318 cm-1处有一极强峰，而园参没有；野山参和林下山参在1 628 cm-1处有一尖峰，而园参相应位置却为一拱形峰。Zhang等[42]发现不同生境的人参在红外光谱和二级衍生光谱1 800～400 cm-1范围内，以及二维同步相关谱1 730～1 045 cm-1和1 730～1 410 cm-1范围内差异明显。基于上述光谱形状和强度的差异，可能作为园参、林下山参和野山参快速识别的依据。而通过与统计学方法的进一步结合，可更准确、快速、有效的识别园参、林下山参和野山参。另外，卜海博等[30]采集了园参和林下山参的近红外光谱，并对光谱进行平滑和多元散射校正等预处理后，结合主成分分析-马氏距离法进行判别分析，所建立的判别模型可以实现园参和林下山参的准确分类。其后续研究采用显微红外光谱技术也实现了林下山参和园参的无损判别[43]。

2.3 成分鉴别 基于成分组成和含量差异，研究者们先后报道了多种判别园参、林下山参和野山参的方法，主要以液相色谱法和液相色谱-质谱联用的方法为主。徐世义[44]建立了野山参、林下山参和园参的HPLC指纹图谱，指出园参与林下山参差别较大，园参总体成分含量明显较林下山参低；林下山参与野山参指纹图谱相似，但野山参所含组分在数量及含量上均高于林下山参，且野山参在保留时间为13 min左右有1个专属性色谱峰。因此通过HPLC指纹图谱的比对，也可将园参、林下山参和野山参初步区分开。Xu等[45]采用UPLC-QTOF-MS/MS技术结合主成分分析等对4～7年生园参和15年生林下山参的代谢物差异进行了研究，基于代谢物差异有效区分了园参和林下山参，并筛选了人参皂苷Ra1等12种差异性成分。朱海林[46]采用UPLC-QTOF-MS/MS技术对12～20年生林下山参与4～6年生园参之间的成分差异进行研究，筛选出三七皂苷R1、丙二酰人参皂苷Rb2等11种区别于园参的林下山参差异性成分，其中9种成分未在园参中检出，而园参中存在人参环氧炔醇等6种区别于林下山参的特异性成分。其后续研究[36]采用UPLC-QTOF/MS技术研究了4～6年生园参、12年和20年生林下山参整体代谢物的差异，筛选出了α-亚麻酸、油酸、亚油酸、人参环氧炔醇、人参皂苷Ro、Rf等17个园参和林下山参的差异代谢物，并建立了OPLS-DA模型，成功将园参和12年生林下山参、园参和20年生林下山参进行了区分。其中α-亚麻酸、油酸、亚油酸和人参环氧炔醇均是园参和12年生林下山参、园参和20年生林下山参的差异代谢物，可能作为鉴别园参和林下山参的依据。

此外，还有研究基于质谱法、凝胶电泳法[47]等对园参、林下山参和野山参中的无机元素、氨基酸、蛋白质等成分种类和含量进行比较，其比较结果也有利于不同生境人参的准确判别。

2.4 分子鉴别 近年来，直接扩增片段长度多态性(DALP)分子标记技术日趋成熟，使得人们可以从分子水平上认识不同生境人参之间的差异，也为其鉴别提供了良好的平台。王帅等[48]采用DALP分子标记技术，建立了林下山参与园参的DALP指纹鉴定图谱，经对比筛选出林下山参共有而园参没有的6条特异性DNA片段，可以作为鉴别林下山参与园参的有效依据。Li等[49]通过对不同人参样品线粒体nad7内含子3区进行多重比对，发现了俄罗斯野山参特有的SNP位点，并基于该位点的差异成功区分了园参和野山参。基于上述文献资料，对不同生长年份、生境人参的判别研究进行归纳，见表1。

表1 不同生长年份、生境人参的判别研究

3 结语

园参、林下山参和野山参的栽培方式和生长环境不同，常见的商品年限也有所差异。国内外研究表明，不同生长年份、不同生境的人参在多种成分种类和含量上存在差异，显微特征及吸收光谱也有所不同，而基于这些差异再结合统计学方法可以建立科学的判别模型，有效判别不同生境的人参及其生长年限。目前研究者们已不局限于对人参皂苷等单一活性成分的研究，而更倾向于对整体代谢物质的比较，力求寻找到与年份、品种、产地相关的差异性或特异性指标成分，为不同年份、不同品种、不同产地人参间的质量和价值差异作出科学解释。

如何科学准确、快速无损地识别人参产地、品种和生长年限等信息，一直是研究者们努力探索的课题。但就目前而言，野山参年份判别相关的研究甚少，且与移山参等趴货的差异性成分仍不明确，有待深入系统的探讨。此外，国内外文献中对半野生和野生人参的称谓都比较混乱，如野生山参、野山人参、林下参、wild ginseng、mountain wild ginseng、wild grown ginseng、cultured/cultivated wild ginseng、forest ginseng、mountain cultivated ginseng等，并未指出其具体的生境，也几乎没有样本图，这给样本来源的准确性判断带来了极大困扰。建议在今后的比较分析研究中，叙述样本采集环境，规范统一样本称谓，并在文章中保留样本的图片资料。