野菊花提取物对慢性支气管炎大鼠肺组织病理的影响及对TGF-β1/Smad3通路的调控机制

李向峰， 陈文霞

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

慢性支气管炎是呼吸系统常见的慢性非特异性炎症反应疾病，多发生在气管、支气管黏膜及周围组织，常见症状有咳嗽、咳痰、喘息等，每年持续发病至少3个月，病程至少2年，可严重影响患者的生活[1]。据统计[2]，我国慢性支气管炎的发病率高达15%，且随着人们社会生活压力的增大和人口老龄化趋势的不断加重而逐年增长，危害甚重。目前临床上常采用抗炎、止咳、化痰等手段治疗慢性支气管炎，但易反复发作。野菊花具有抗菌消炎、清热去火、消肿止痛、清肝明目等功效，既往研究表明野菊花提取物——绿原酸对肺炎克雷伯菌生物膜有体外抑制作用[3]，推测可治疗支气管炎。转化生长因子-β1(TGF-β1)/信号传导蛋白Smad3通路在多种炎症反应相关疾病的发生和发展中均积极参与，TGF-β1、Smad3 信使核糖核酸(mRNA)及蛋白激活可介导促炎症因子的合成与分泌，增加炎症反应性组织损伤[4-6]。但是野菊花提取物是否能够通过调控上述信号通路发挥保护慢性支气管炎大鼠肺组织的作用仍需深入探讨。鉴于此，本研究特选取60只SD成年雄性大鼠设计动物实验，旨在探讨上述问题，挖掘野菊花提取物在慢性支气管炎治疗中的临床价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只SD成年健康雄性大鼠，无特定病原体(SPF)级，7～9周龄，体质量(210±20)g，均购自南方医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK(粤)2018-0007。

1.1.2 试剂及仪器 大前门牌香烟(上海烟卷公司，批号20190115)。野菊花提取物(江西桂丰科技有限公司，绿原酸纯度≥98%，批号180321)；N-乙酰半胱氨酸(北京华迈科生物技术有限责任公司，批号180214A)；生理盐水(上海生工生物工程技术有限公司，批号180622)；TGF-β1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒(华美生物工程公司，批号180501C、180413A、180322B)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(北京诺博莱德科技有限公司，批号181020A)；甲醛(北京华腾天海环保科技有限公司，批号180706)；Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司，批号AH1801053)；TGF-β1、Smad3、β-actin引物序列，由上海铂尚生物工程有限公司合成；二甲喹啉酸(BCA)试剂盒(凯基生物科技发展有限公司，批号1810170)；细胞裂解液(上海生物工程技术公司，批号1804051)；兔抗鼠TGF-β1、Smad3 单克隆抗体(一抗，1∶1 000)、山羊抗兔TGF-β1、Smad3 多克隆抗体(二抗，以辣根过氧化物酶标记，1∶5 000)(美国Santa Cruz 公司，批号201806A、201805B、201810C、201811A)；12%十二烷基硫磺胺-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)[购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，批号1807085]。

Allegra X-15R型台式离心机(美国Beckman Coulter公司)；DSX100型光学显微镜(日本Olympus公司)；9700型聚合酶链反应(PCR)扩增仪(美国ABI公司)；CFX96型转膜仪(美国Bio-Rad公司)；GP200型电泳仪(托摩根生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组、建模及给药 60只大鼠随机分为正常组、模型组、阳性组及野菊花提取物低、中、高浓度组，每组10只。除正常组外，其余5组均采用改良烟熏法建立慢性支气管炎模型，具体参照文献[7]报道的方法制作烟熏箱罩(550 mm×330 mm×390 mm)，顶部对角留2个通气孔(20 mm×30 mm)，将烟熏箱罩放置于钢丝笼中，在钢丝笼正下方放置香烟，点燃后将大鼠放置于烟熏箱罩中，香烟燃尽后迅速点燃另1支，每次共点燃8支，烟熏3次，持续70 d。参照《慢性支气管炎小鼠模型构建方法的改良与评价》[8]，验证模型是否成功。取低、中、高浓度组中建模成功的大鼠，分别予以0.7、1.4、2.8 g/kg野菊花提取物(给药前采用TLC法鉴定[9])灌胃，每天1次，取正常组和建模成功的模型组大鼠，予以等量生理盐水灌胃，每天1次；取建模成功的阳性组大鼠，予以50 mg/kgN-乙酰半胱氨酸灌胃，每天1次。各组均干预3周。

1.2.2 ELISA检测大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平 于干预前后取大鼠股动脉血，制备抗凝血，3 500 r/min离心10 min，取上清液，严格按照ELISA检测试剂盒的说明书操作。将大鼠处死后，立即取右侧新鲜肺组织，保存备用。

1.2.3 HE染色观察大鼠肺组织病理变化 取大鼠右侧新鲜肺组织1 cm×1 cm×1 cm，固定于4%甲醛中，石蜡包埋后切片，HE染色，中性树胶封片，光镜下观察肺组织病理变化。

1.2.4 四级评分法评价大鼠病理变化 包括支气管黏膜病变、支气管壁病变、基底部炎性细胞浸润、血管瘀血状况、肺泡间隔病变，分别以0、1、2、3分表示无、轻度、中度、重度，评分越高，肺组织病理变化程度越严重。

1.2.5 逆转录实时PCR(RT-qPCR)检测大鼠肺组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达 将大鼠肺组织匀浆，采用Trizol试剂盒提取总RNA后逆转录。参照基因库信息设计TGF-β1、Smad3、β-actin引物序列，其中TGF-β1正向5′-CTCGCTCGATAGCT AGATCTAGATATATAGCTAG-3′，反向5′-TCGCTCG AATAGATCAAAGCTAGCTTGTGTCG-3′，长度241 bp；Smad3正向5′-TCGCTAGATTGCGCGCG AGAGAGAGAGCTAA-3′，反向5′-TCGATAGATC AGTTTGTCGACCGATGATCGA-3′，长度213 bp；β-actin正向5′-TCGCTAGATAGACAAGAGGGCTA GCTATGA-3′，反向5′-TCCGCTAGCTAGTATAGC TAGATAATAATCT-3′，长度200 bp。常规配置反应体系，总量25 μL，PCR反应条件为94 ℃ 30 s，35个循环，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，60 ℃ 90 s，最后72 ℃ 5 min，室温条件下将扩增产物自然冷却，电泳，测得目的基因相对表达量，即2-△△CT。

1.2.6 蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测TGF-β1、Smad3蛋白表达 常规取大鼠肺组织匀浆，细胞裂解后以BCA试剂盒定量总蛋白，常规加入上样缓冲液，以12% SDS-PAGE进行电泳，取转膜仪转膜，以脱脂奶粉室温封闭，2 h后向其中加入一抗，室温孵育，次日洗膜，加入二抗，室温下孵育，2 h后显影成像，采用Plus软件扫描，测得目的蛋白的相对表达量，即目标蛋白灰度值/β-actin灰度值。

2 结果

2.1 各组大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平 模型组，阳性组和低、中、高浓度组分别有2、1、1、1、0只大鼠未建模成功，成功率为90.00%(45/50)；模型组和低浓度组各有1只大鼠死亡，均剔除本研究。干预后，正常组大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平均无明显变化(P>0.05)，模型组上述指标均升高(P<0.01)，其余4组均降低(P<0.05)。干预前，模型组血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平均高于正常组(P<0.01)；干预后，阳性组和野菊花提取物组水平均低于模型组(P<0.01)，而且后一组呈剂量依赖性，见表1。

表1 各组大鼠血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平比较

2.2 大鼠肺组织病理变化 正常组大鼠支气管黏膜细胞排列紧密，结构均匀，细胞饱满，支气管壁结构正常，未见炎性细胞浸润，肺泡间隔基本正常(图1A)；模型组大鼠支气管黏膜有大量细胞变性、坏死、脱落，支气管壁出现严重的炎性充血、水肿表现，有大量炎性细胞浸润，肺泡间隔严重不均(图1B)；阳性组支气管黏膜有部分细胞变性、坏死、脱落，支气管壁有明显的炎性充血、水肿表现，有部分炎性细胞浸润，部分肺泡间隔增宽(图1C)；低浓度组支气管黏膜有明显细胞变性、坏死、脱落表现，支气管壁有显著炎性充血、水肿症状，有大部分炎性细胞浸润，大量肺泡间隔增宽(图1D)；中浓度组支气管黏膜有少部分细胞变性、坏死、脱落表现，支气管壁有炎性充血、水肿症状，有部分炎性细胞浸润，少部分肺泡间隔增宽(图1E)；高浓度组支气管黏膜有轻微细胞变性、坏死、脱落表现，支气管壁轻微炎性充血、水肿，极少部分炎性细胞浸润，极少部分肺泡间隔轻微增宽(图1F)。

注：A～F分别为正常组、模型组、阳性组、低浓度组、中浓度组、高浓度组。图1 大鼠肺组织病理变化观察(HE染色，×200)Fig.1 Pathological changes of rat lung tissues (HE staining, ×200)

2.3 大鼠肺组织病理评分比较 各组大鼠支气管黏膜病变、支气管壁病变、基底部炎性细胞浸润、血管瘀血状况、肺泡间隔病变评分比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，由高到低依次为模型组、低浓度组、阳性组、中浓度组、高浓度组、正常组，组间两两比较，差异也均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠肺组织病理评分比较(分，

2.4 大鼠肺组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，由高到低依次为模型组、低浓度组、阳性组、中浓度组、高浓度组、正常组，组间两两比较，差异也均有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达比较

2.5 大鼠肺组织TGF-β1、Smad3蛋白表达 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3 蛋白表达比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，由高到低依次为模型组、低浓度组、阳性组、中浓度组、高浓度组、正常组，组间两两比较，差异也均有统计学意义(P<0.01)，见表4、图2。

表4 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3蛋白表达比较

图2 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3蛋白表达Fig.2 TGF-β1, Smad3 protein expressions in rat lung tissues in various groups

3 讨论

有报道指出[10]，慢性支气管炎患者血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平异常升高，且与疾病严重程度紧密相关。TGF-β1属于细胞生长和分化调节因子，可参与气道慢性炎症和气道重塑，引起气管壁炎性细胞浸润，促进疾病的进展。TNF-α和IL-6均是此类患者临床常用的炎症反应程度评估指标，在炎症反应性疾病中呈增高趋势，导致局部组织炎症性损伤[11]。因此在慢性支气管炎患者治疗期间需积极控制其炎症反应，但如何更有效地减轻肺组织炎性损伤仍需进一步研究。

本研究显示，干预后阳性组和野菊花提取物组血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平下降，而模型组上述指标均升高，且低浓度组均高于阳性组，阳性组均高于中浓度组和高浓度组，中浓度组均高于高浓度组，可知随着慢性支气管炎病情的发展，血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平可升高，而给予N-乙酰半胱氨酸和野菊花提取物治疗均可控制慢性支气管炎的血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平，且高浓度野菊花提取物的作用更佳。此外，各组肺组织病理变化观察结果显示，正常组大鼠支气管黏膜、支气管壁结构、肺泡间隔表现均正常，模型组均可见严重的细胞变性、坏死、脱落表现，且有大量炎性细胞浸润，肺泡间隔严重不均，阳性组和野菊花提取物组均好转，各项评分比较结果与病理学检查结果均一致，证实研究药物可减轻慢性支气管炎大鼠的肺组织病理损伤，发挥对支气管黏膜、气管壁等局部结构组织的保护作用。野菊花性凉，辛，味苦，有清热解毒的功效。慢性支气管炎的主要中医病因为外邪入侵、内火上亢，故清热解毒乃对症治疗[12]。相关研究证实[13-14]，野菊花中的有效成分绿原酸不仅具有抗炎、抗氧化应激反应的作用，还可减轻肺损伤，保护肺组织功能，与本研究结果相符。因此野菊花提取物在慢性支气管炎患者的临床治疗方面显示出良好的开发价值。

此外，本研究还显示，干预后阳性组和野菊花提取物组肺组织TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达均低于模型组，均高于正常组，而模型组肺组织TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达均高于正常组，提示慢性支气管炎大鼠肺组织TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达可异常升高，而给予N-乙酰半胱氨酸和野菊花提取物可下调其表达，且野菊花提取物的浓度越高，对肺组织TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达的抑制作用越强烈。TGF-β1可通过细胞内外信号转导通路加重慢性支气管炎肺组织炎性细胞浸润和局部组织损伤，还可推动肺纤维化的形成和发展，促进促炎症因子分泌，诱导细胞合成大量的细胞外基质，并抑制其降解[15-16]。Smad3是TGF-β信号通路的拮抗剂，可调控细胞外基质的积聚，还可调节促炎症因子分泌，与TGF-β1形成信号通路[17]。有研究显示[18]，在慢性支气管炎大鼠模型中，TGF-β1、Smad3基因及蛋白均高表达，可促进TNF-α、IL-6水平增长，而两者均可加重肺组织炎性细胞浸润和炎症反应损伤，且TNF-α、IL-6水平较高，给予小承气汤干预能通过调控该信号通路，减轻病理损伤。因而推测野菊花提取物也可调控上述通路治疗慢性支气管炎。

综上所述，在慢性支气管炎大鼠中给予野菊花提取物灌胃可减轻炎症反应，控制肺组织病理改变，且中浓度和高浓度的野菊花提取物作用效果优于N-乙酰半胱氨酸对照物，显示出良好的开发前景，推测该药物是通过调控TGF-β1/Smad3 信号通路，抑制TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达实现肺组织保护作用的。但关于该药物是否对慢性支气管炎有其它治疗机制仍需进一步研究，可作为后续的探讨方向。