UHPLC-MS/MS法同时测定肠激安方冻干粉中10种成分

吴映秀， 唐洪梅， 王永福， 张毅靖， 黄育生， 甘剑峰

(1.佛山市中医院，广东 佛山 528000；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；3.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；4.广州中医药大学岭南医学研究中心，广东 广州 510405)

肠激安方由白芍、白术、黄芪、黄连、陈皮、防风、延胡索等13味药材组成，为四君子汤、痛泻要方加减而来，具有益气健脾、止痛止泻的功效[1-2]，也是广州中医药大学第一附属医院用于治疗肝郁脾虚腹泻型肠易激综合征的临床验方，疗效确切，含有丰富的生物碱、黄酮、苷类等成分，具有较强的药理活性。方中白芍活性成分芍药苷具有抗抑郁、免疫调节等药理作用[3]，黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷抗氧化、抗肿瘤、保护神经细胞[4-5]，陈皮、枳壳中黄酮苷保肝、促进胃肠动力[6-8]，防风中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素具有镇痛解热、抗菌、抗炎等作用[9-10]，黄连中盐酸小檗碱止泻、巴马汀抗菌[11-12]，延胡索中延胡索乙素具有镇痛止痛等作用[13-14]。课题组前期测定了肠激安方中芍药苷、白术内酯I、盐酸小檗碱的含量[15]，但尚未涉及其他成分，并且也无其他相关报道。因此，本实验通过UHPLC-MS/MS法同时测定肠激安方冻干粉中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、柚皮苷、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、延胡索乙素的含量，为该方质量标准建立奠定基础，也为含有相同成分其他制剂的含量检测提供参考。

1 材料

1.1 仪器 TSQ-Quantum高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(配置Accela型高压泵、ESI离子源、Accela型自动进样器)、低温高速离心机(美国Thermo Fisher公司)；Advantage A10超纯水系统(美国Millipore公司)；XS205DU型电子分析天平(十万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；恒温数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 橙皮苷(批号C-006-180216)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号J-002-170731)、升麻素(批号S-007-170426)对照品均购于成都瑞芬思生物科技有限公司；毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号AF8060408)、芍药苷(批号AF9030313)、升麻素苷(批号AF9012102)、盐酸小檗碱(批号AF8062709)、柚皮苷(批号AF9072221)、盐酸巴马汀(批号AF9102703)、延胡索乙素(批号AF8111993)对照品均购于成都埃法生物科技有限公司；胡椒碱对照品购于中国食品药品检定研究院，批号110775-201405，以上对照品纯度均≥98.0%。肠激安方中各药材饮片均购于广州中医药大学第一附属医院中药房，经医院药检室专家鉴定为正品，各3批，具体信息见表1。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，购于德国Merck公司。

表1 各饮片信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Phenomenex-C18色谱柱(2 mm×50 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脱(0～2.0 min，5%A；2.0～3.0 min，5%～30%A；3.0～4.0 min，30%A；4.0～5.0 min，30%～95%A；5.0～5.5 min，95%～5%A；5.5～7.0 min，5%A)，每次进样前以5%A预平衡15 min；体积流量0.7 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，喷雾电压3 000 V(负离子)、3 500 V(正离子)；鞘气(N2)压力30 psi(1 psi=0.133 kPa)；辅气(Ar)压力10 psi；汽化室温度350 ℃；离子传输管温度300 ℃；全扫描、选择离子监测(SRM)模式，正负离子同时扫描。质谱参数见表2，色谱图见图1。

表2 各成分质谱参数

1.芍药苷 2.毛蕊异黄酮葡萄糖苷 3.橙皮苷 4.柚皮苷 5.升麻素苷 6.升麻素 7.5-O-甲基维斯阿米醇苷 8.盐酸小檗碱 9.盐酸巴马汀 10.延胡索乙素 11.胡椒碱(内标)1.paeoniflorin 2.calycosin-7-O-β-D-glucoside 3.hesperidin 4. naringin 5.prim-O-glucosylcimifugin 6.cimifugin 7.4′-O-β-glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol 8.berberine hydrochloride 9.palmatine hydrochloride 10.tetrahydropalmatine 11.piperine (internal standard)图1 各成分提取离子流色谱图Fig.1 Extracted ion current chromatograms of various constituents

2.3 对照品、内标溶液制备 精密称取芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、柚皮苷、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、延胡索乙素、胡椒碱对照品适量，甲醇分别制成345、211、248、260、282、262、234、242、245、325、114 μg/mL贮备液，置于4 ℃冰箱中密封保存。分别精密吸取上述对照品适量，甲醇稀释至10、1 μg/mL溶液。将内标同法制得10 μg/mL溶液，备用。

2.4 供试品溶液制备 按组方称取药材，加入4倍量超纯水浸泡30 min，加热煮沸后小火煎煮40 min，过滤药液，药渣加3倍量超纯水煮沸后小火煎煮30 min，滤出药液，滤液合并浓缩至稠膏状，-80 ℃下保存，按冻干机操作制成冻干粉(批号分别为CJA20180101、CJA20180301、CJA20180401)，得率分别为20.0%、19.40%、18.98%，-20 ℃下保存备用。精密称取肠激安方冻干粉0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入10 μg/mL内标溶液1 mL、70%甲醇9 mL，称定质量，超声(功率300 W、频率40 kHz)提取30 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，3 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，精密吸取1.0 mL滤液，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取“2.3”项下对照品溶液适量，甲醇逐级稀释，加入内标溶液混匀，制得系列质量浓度的标准曲线工作液。以待测成分与内标峰面积比值为纵坐标(Y)，待测成分质量浓度为横坐标(X)进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系

2.5.2 精密度试验 精密吸取“2.3”项下对照品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定6次，测得芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、柚皮苷、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和延胡索乙素含量RSD分别为1.21%、1.88%、1.78%、2.17%、2.03%、1.32%、2.84%、1.65%、1.92%、2.36%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 精密称取同一批冻干粉(CJA20180101)0.5 g，按“2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、柚皮苷、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、延胡索乙素含量RSD分别为2.05%、2.43%、0.76%、2.47%、2.23%、2.32%、2.52%、2.15%、1.98%、1.81%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液(CJA20180101)，室温下放置0、2、4、8、12、24 h后在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、柚皮苷、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、延胡索乙素含量RSD分别为2.23%、1.29%、1.30%、2.80%、2.53%、1.68%、2.96%、2.23%、1.88%、2.05%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验 称取各成分含量已知的同一批冻干粉(CJA20180101)0.25 g，共6份，精密加入对照品溶液适量(芍药苷0.065 9 mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.001 5 mg、橙皮苷0.034 9 mg、柚皮苷0.056 8 mg、升麻素苷0.011 5 mg、升麻素0.002 1 mg、5-O-甲基维斯阿米醇苷0.005 8 mg、盐酸小檗碱0.030 4 mg、盐酸巴马汀0.009 8 mg、延胡索乙素0.001 9 mg)，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，计算回收率。结果，芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、柚皮苷、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、延胡索乙素平均加样回收率分别为89.71%、90.68%、86.64%、85.92%、88.75%、92.86%、95.52%、101.12%、98.76%、86.78%，RSD分别为2.91%、2.31%、1.15%、1.56%、1.78%、2.85%、3.64%、4.13%、3.57%、2.88%。

2.6 样品含量测定 精密称取不同批次冻干粉0.5 g，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果(mg/g,n=3)

3 讨论

3.1 色谱条件筛选 本实验考察甲醇-水、甲醇-水(含0.1%甲酸)、乙腈-水、乙腈-水(含0.1%甲酸)对色谱峰的影响，发现以乙腈-水(含0.1%甲酸)为流动相时响应值高，峰形较好，故选其作为流动相。

3.2 质谱条件筛选 本实验先将各对照品溶液在全扫描模式(Full scan)下确定母离子、碎片离子信息及离子模式(正或负)，再根据各成分的离子对在SRM扫描模式下进行样品的分析[16]。在离子检测模式考察中发现，芍药苷、橙皮苷、柚皮苷在负离子模式下响应较好，其余成分在正离子模式下响应较好，故采用正负离子同时扫描，以确保各成分能在各自最佳电离模式下检测，而且灵敏度高。

3.3 提取条件筛选 本实验先采用不同提取溶剂进行优化，结果确定为甲醇。再考察50%甲醇、70%甲醇、甲醇对样品提取的影响，发现70%甲醇效果最佳，故选择其作为提取溶剂。另外，为了使测定结果更准确，减少因操作条件等变化引起的误差，本实验采用内标法进行含量测定。

4 结论

本实验建立了UHPLC-MS/MS法同时测定肠激安方冻干粉中芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、柚皮苷、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、延胡索乙素的含量，该方法灵敏、简便、快速，可为该方药效物质基础研究提供参考，也可用于相关制剂的质量控制与评价。