艾灰黄酮超声提取工艺的优化及其抑菌活性

王慧芳， 程叶新， 白金虎， 王文瑞， 孟戎茜， 辛先荣， 赵润柱， 张恒慧

(1.太原工业学院化学与化工系，山西 太原 030008；2.太原工业学院环境与安全工程系，山西 太原 030008)

艾叶中主要含有挥发油、黄酮、鞣质、多糖等有效成分，具有温经、止血、散寒、去湿、止咳、消炎、抗过敏等多种功效[1-2]，将其晒干捣碎得艾绒后制成艾条，可供艾灸用，它通过温热刺激来使局部皮肤充血，毛细血管扩张，促进炎症、粘连、血肿等病理产物消散吸收，起到行气通络、扶阳固脱、提高人体免疫力等作用，是中医传统防病治病方法[3-5]。

黄酮是一类拥有提高机体免疫力、防治心血管疾病等多种生理活性的化合物，有着广泛的抗氧化、抑菌活性[6-8]，艾绒中也有大量该类成分[9]。艾灸产物有烟雾和灰烬，人们对前者研究较多[10-13]，而鲜有涉及后者，文献[14-15]报道，艾灰在医疗保健方面有着广泛的用途，如治疗脚气、褥疮、疮疡出血等，其止血、清除自由基效果较艾叶更强。课题组前期对灸灰中有效成分进行提取后，发现其中仍有部分黄酮，其原因可能是艾灸过程中艾绒燃烧不充分所致。为进一步研究艾灸产物生物活性，本实验采用超声法提取艾灰黄酮，优化其提取工艺，并测试其粗提液、发酵液对3种革兰氏菌的抑制作用，以期为相关产物的开发利用提供依据。

1 材料

艾绒(陈艾)购自华夏艾灸网，经山西中医药大学裴香萍副教授鉴定为正品。芦丁对照品(纯度>98%，编号PL-001X)购自中国计量院标准物质中心；茶多酚(纯度>98%，编号JP-0263)对照品购自今品化学技术(上海)有限公司。JP-030S型超声波清洗器购自深圳洁盟清洗设备有限公司；VIS-7220型光度计购自成都科析电子商务有限公司；LRH-150型恒温培养箱购自山东博科科学仪器有限公司；R-3001电动升降旋转蒸发仪购自郑州长城科工贸有限公司。大肠杆菌(CGMCC 44568)、枯草芽孢杆菌(CGMCC 10089)来源于中微保管理中心；金黄色葡萄球菌株(CGMCC 26085)来源于中医保管理中心。安琪高活性酵母粉(安琪酵母股份有限公司)。无水乙醇、浓盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氯化钠、氢氧化钠等为分析纯(天津化学试剂厂)。

2 方法与结果

2.1 艾灰黄酮提取及其发酵液制备 将艾绒点燃，模拟艾灸的情景暗火燃烧后得艾灰，称取1 g，加入一定量乙醇，超声处理一段时间后水浴加热浸提1 h，2 000 r/min离心10 min，取上层清液，在50～55 ℃下蒸出溶剂后得浓缩液，室温下晾干冷藏。在上述提取液(浓缩前)中加入0.1 g酵母粉，于30 ℃恒温箱中发酵16 h，即得发酵液，冷藏备用。

2.2 艾灰黄酮含量测定

2.2.1 线性关系考察 按文献[16]报道的方法，以芦丁质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=13.26X+0.004 500(R2=0.992 8)，在0～0.040 00 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 稳定性试验 按文献[17]报道的方法配制0.100 0 mg/mL芦丁对照品溶液，静置0、2、4、6、8、10 h后按“2.2.1”项下方法测定吸光度，测得其RSD为0.164 0%，表明溶液在10 h内稳定性良好。

2.2.4 精密度试验 取0.100 0 mg/L芦丁对照品溶液，按“2.2.1”项下方法连续测定吸光度6次，测得其RSD为0.634 0%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 加样回收率试验 取9份0.032 40 mg/L艾灰粗提液(或发酵液)各10 mL，加入0.045 20、0.032 40、0.021 70 mg/L芦丁对照品溶液各10 mL，75%乙醇定容至50 mL，按“2.2.1”项下方法测定吸光度，测得其平均加样回收率为100.267%，RSD为1.260%。

2.3 单因素试验

2.3.1 乙醇体积分数 取艾灰1 g，设定液料比为30∶1，乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%，超声振荡30 min，在80 ℃恒温水浴中提取1 h，离心，取上层清液，定容至100 mL，按“2.2.1”项下方法测定吸光度，计算提取率，结果见图1。由此可知，提取率随着乙醇体积分数增加而升高，其原因是黄酮极性与乙醇相当，后者体积分数增大有利于前者溶出，在70%时最高，为0.700 0%；但乙醇体积分数进一步增大时，艾灰中亲脂性成分也会随之溶出，导致提取率反而降低。因此，确定乙醇体积分数为70%。

图1 乙醇体积分数对提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate

2.3.2 液料比 取艾灰1 g，设定乙醇体积分数为70%，液料比分别为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1，超声振荡30 min，在80 ℃恒温水浴中提取1 h，离心，取上层清液，定容至100 mL，按“2.2.1”项下方法测定吸光度，计算提取率，结果见图2。由此可知，随着乙醇用量增加，艾灰浸润程度逐渐加强，溶剂传质作用提升[18]，从而使艾灰黄酮释放量升高，液料比为30∶1时最高；但乙醇用量进一步增加时，脂溶性杂质也会随之溶出，导致黄酮提取率降低。因此，确定液料比为30∶1。

图2 液料比对提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate

2.3.3 超声时间 取艾灰1 g，设定乙醇体积分数为70%，液料比为30∶1，超声时间分别为15、20、25、30、35、40 min，在80 ℃恒温水浴中提取1 h，离心，取上层清液，定容至100 mL，按“2.2.1”项下方法测定吸光度，计算提取率，结果见图3。由此可知，当超声时间在15～30 min时，提取率随着超声时间延长而升高，在30 min时达到最高，其原因是超声波具有较强的声冲流和声空化作用，能加速细胞壁的破碎[19]，从而使黄酮溶出率增大；但超声时间进一步延长时，杂质溶出量也会随细胞壁破碎度的增加而升高，导致黄酮提取率降低。因此，确定超声时间为30 min。

图3 超声时间对提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasound time on extraction rate

2.3.4 水浴温度 取艾灰1 g，设定乙醇体积分数为70%，液料比为30∶1，超声时间为30 min，水浴温度分别为40、50、60、70、80、90 ℃，恒温提取1 h，离心，取上层清液，定容至100 mL，按“2.2.1”项下方法测定吸光度，计算提取率，结果见图4。由此可知，水浴温度在40～70 ℃时黄酮提取率随着其增加而升高，在70 ℃时达到最高，为1.037%；但水浴温度进一步升高时，黄酮结构会被破坏[20]，导致黄酮提取率降低。因此，确定水浴温度为70 ℃。

图4 水浴温度对提取率的影响Fig.4 Effect of water bath temperature on extraction rate

2.4 响应面法优化 单因素试验结果表明，水浴温度(A)、液料比(B)、乙醇体积分数(C)对艾灰黄酮提取率(Y)的影响较大，故选择三者进行响应面试验，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平

表2 试验设计与结果

表3 方差分析

响应面图反映了各因素对响应值的影响程度，而等高线反映了其相互作用强度[21]。图5显示，液料比、水浴温度曲线较陡，即对响应值的影响较大；乙醇体积分数的响应面曲线则相对平缓，即对响应值的影响较小；水浴温度、乙醇体积分数等高线的两两交互作用较显著，曲线呈椭圆形，而其余等高线接近圆形，即两两交互作用不显著。

图5 各因素响应面图Fig.5 Response surface plots for various factors

结果表明，最优提取条件为水浴温度84.36 ℃，液料比48.51∶1，乙醇体积分数30.22%，艾灰黄酮提取率1.105%，根据实际情况，将其修正为水浴温度85 ℃，液料比50∶1，乙醇体积分数30%。再进行3次验证试验，测得艾灰黄酮平均提取率为1.092%，与预测值1.105%的偏差仅为0.013 00%，表明模型稳定可靠，拟合度良好。

2.5 抑菌活性实验

2.5.1 药液制备 将0.001 000 g酵母加到10 mL 0.100 0 g/mL提取液中，于28 ℃下恒温培养48 h后得发酵液，冷藏。50%乙醇配制艾灰黄酮粗提物、发酵液、芦丁、茶多酚供试液(0.100 0 g/mL)，采用二倍稀释法，蒸馏水稀释至20.00～1.560、10.00～1.250 mg/mL，即得。

2.5.2 菌种扩培与含菌培养基制备 被测菌株按文献[23]报道的方法扩培，吸取1×108CFU/mL菌悬液1 mL至BPDA培养基中，涂布均匀，于30 ℃恒温箱中培养1 h，即得。

2.5.3 抑菌实验 将相同直径的滤纸片在供试液中浸泡15 min后，均匀放置在含菌培养皿中(每皿3个，分别为无菌水、艾灰黄酮粗提液及同浓度发酵液)，同一温度下培养72 h后观察，平行3次，取平均值，计算抑菌圈直径，公式为抑菌圈直径=抑菌圈外径-滤纸片直径。再移取菌悬液0.100 0 mL、不同质量浓度被测液各1 mL，加到灭菌冷却后的培养基上，涂布均匀后恒温培养，观察不同条件下菌落生长情况，以粗提液、发酵液不长菌的最低质量浓度为最低抑菌浓度(MIC)[24]。

2.5.4 统计学分析 采用Origin 8.0软件处理数据，再通过SPASS 17.0软件进行统计学分析。

2.5.5 结果分析 表4～5显示，发酵液对3种细菌的抑制作用均强于粗提液，其中粗提液对大肠杆菌的抑制作用最强，对金黄色葡萄球菌最弱，并均弱于茶多酚、芦丁；发酵液在高质量浓度(10.00 mg/mL)下对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强，而低质量浓度(2.500～5.000 mg/mL)时对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强；当发酵液质量浓度为5.000 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于芦丁，而为2.500 mg/mL时对3种细菌的抑制作用均强于茶多酚、芦丁。

表4 3种细菌MIC测定结果

表5 3种细菌抑菌圈直径测定结果

3 讨论与结论

艾灰黄酮最佳超声提取工艺为乙醇体积分数30%，液料比50∶1，超声振荡30 min后在85 ℃恒温水浴中提取1 h，提取率为1.092%，与预测值(1.105%)偏差仅为0.013 00%，表明模型拟合度良好。

抑菌活性实验结果表明，艾灰黄酮粗提液、发酵液均对待测菌株有一定抑制作用，并且后者明显更强，其原因可能是发酵有利于该成分含量的提升[25]；发酵液抑菌效果受药液浓度的影响较小，在2.500 mg/mL时的作用与对照药芦丁、茶多酚在5.000 mg/mL时的相当，可见发酵对提高其活性非常有效，以发酵液代替提取液可有效降低药液使用量。值得注意的是，发酵液中黄酮含量会因发酵条件不同而发生变化[26]，故后期应对上述方面进行更深入的探究。