哈巴苷通过抑制miR-1246表达对LPS诱导的人牙周膜细胞损伤的影响

吴 源 高 鹏 李海涛 （青海红十字医院口腔科，西宁810000）

牙周病是常见的口腔疾病，人牙周膜细胞（hu⁃man periodontal ligament cells，hPDLCs）是牙周结缔组织中重要的间质细胞，在牙周组织的增殖中起重要作用，hPDLCs损伤可分泌多种细胞因子影响牙周病的发生；而脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是公认的炎症启动因子［1-2］。哈巴苷是玄参中的主要成分，具有抗氧化及保护细胞免受损伤的作用，如哈巴苷能通过抑制氧化应激抑制心肌细胞H9c2 凋亡［3］。哈巴苷可通过激活 Wnt/β-catenin 信号传导途径来减轻大鼠脊髓损伤后神经元凋亡并促进轴突再生［4］。哈巴苷可通过激活PI3K/Akt信号通路改善 Aβ25-35 诱导的 PC12 细胞毒性［5］。然而哈巴苷对hPDLCs 损伤的影响及机制尚不清楚。研究报道miR-1246 过表达加剧了LPS 诱导的软骨细胞活力下降，细胞凋亡增加和促炎因子的过度产生［6］。miR-1246 在LPS 诱导的肺动脉内皮细胞损伤中高表达，干扰其表达可抑制LPS 诱导的细胞凋亡和炎症因子 IL-1β 和 TNF-α 的释放［7］。但 miR-1246 对LPS诱导hPDLCs损伤的影响，以及哈巴苷是否通过调控miR-1246 的表达影响LPS 诱导的hPDLCs 损伤目前还尚未可知。因此，本实验旨在研究哈巴苷是否通过调控miR-1246 的表达影响LPS 诱导的hP⁃DLCs损伤。

1 材料与方法

1.1 材料 hPDLCs（货号：RC-CELL-0185，上海诺辰生物技术有限公司）；DMEM 培养液（货号：319-005-CL，北京泰泽嘉业科技发展有限公司）；哈巴苷（货号：111728，上海雅吉生物科技有限公司）；脂多糖（货号：L2880，美国Sigma 公司）；TNF-α 酶联免疫吸附试剂盒（货号：E-EL-H0109c，武汉巴菲尔生物技术服务有限公司）、IL-1β 酶联免疫吸附试剂盒（货号：E-EL-H0149c，武汉巴菲尔生物技术服务有限公司）；Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（货号：P-CA-201，武汉益普生物科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液（货号：QCB-3201-1，上海钦诚生物科技有限公司）；BCA 试剂盒（货号：23227，北京诺博莱德科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞处理与分组 hPDLCs用含20%胎牛血清的DMEM 培养液培养，取第3代细胞，用10 μg/ml LPS 处理作为 LPS 组，分别用浓度为 20 μmo/l L、40 μmo/l L、80 μmo/l L 的哈巴苷和 10 μg/ml LPS 处理，作为哈巴苷低、中、高浓度组，不做处理的为Con组；将 anti-miR-NC、anti-miR-1246 转染至 hPDLCs 后用 10 μg/ml LPS 处理，记为 LPS+anti-miR-NC 组、LPS+anti-miR-1246 组 ；miR-NC、miR-1246 转 染 至hPDLCs后用80 μmo/l L的哈巴苷和10 μg/ml LPS处理，记为LPS+HG+miR-NC组、LPS+HG+miR-1246组。

1.2.2 ELISA 检测TNF-α、IL-1β 水平 取1.2.1各组细胞培养上清，具体按照试剂盒操作进行检测。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 取各组细胞，洗涤后用结合缓冲液重悬，加入10 μl 的Annexin V-FITC 和5 μl 的PI，混匀，避光孵育 10 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 Western blot 检测蛋白表达 用RIPA 蛋白裂解液提取细胞总蛋白，再用BCA 试剂盒进行定量。蛋白样品变性后进行SDS-PAGE，转至PVDF上，脱脂牛奶封闭后加入相应的一抗，4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，加入电化学发光液显影，定影成像后分析蛋白条带灰度值，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。

1.2.5 RT-qPCR 检测miR-1246 表达水平 提取细胞总 RNA，反转录成 cDNA，miR-1246 以U6 为内参进行 PCR 扩增，相对表达量用 2-ΔΔCt法计算。miR-1246 上游引物序列：5'-AATGGATTTTTGGAGCAGG-3'，下游引物序列：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6 上游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCA⁃CA-3'，下游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTT⁃GCGT-3'。

1.3 统计学分析 用SPSS20.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 哈巴苷对LPS诱导的hPDLCs炎症因子表达的影响 与 Con 组比较，LPS 组 hPDLCs 中 TNF-α、IL-1β 水平升高（P<0.05）；与 LPS 组比较，哈巴苷低、中、高浓度组hPDLCs中TNF-α、IL-1β水平降低，且呈浓度依赖性（P<0.05，表1）。

表1 哈巴苷对LPS 诱导的hPDLCs 炎症因子表达的影响（，ng/ml，n=9）Tab.1 Effect of harpagide on expression of inflammatory factors in human periodontal ligament cells in⁃duced by LPS（，ng/ml，n=9）

表1 哈巴苷对LPS 诱导的hPDLCs 炎症因子表达的影响（，ng/ml，n=9）Tab.1 Effect of harpagide on expression of inflammatory factors in human periodontal ligament cells in⁃duced by LPS（，ng/ml，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+HG-L group，3）P<0.05；com⁃pared with LPS+HG-M group，4）P<0.05.

IL-1β 2.39±0.22 13.19±1.071）9.69±0.862）6.32±0.512）3）3.33±0.232）3）4）404.409 0.000 Groups Con LPS LPS+HG-L LPS+HG-M LPS+HG-H F P TNF-α 4.22±0.37 9.88±0.621）7.88±0.482）6.23±0.282）3）5.04±0.232）3）4）262.702 0.000

2.2 哈巴苷对LPS诱导的hPDLCs凋亡的影响 与Con 组比较，LPS 组 hPDLCs 凋亡率升高，Bcl-2 表达水平降低，Bax 表达水平升高（P<0.05）；与LPS 组比较，哈巴苷低、中、高浓度组hPDLCs凋亡率降低，Bcl-2表达水平升高，Bax 表达水平降低，且呈浓度依赖性（P<0.05，图1、表2）。

表2 哈巴苷对LPS诱导的hPDLCs凋亡的影响（，n=9）Tab.2 Effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs（，n=9）

表2 哈巴苷对LPS诱导的hPDLCs凋亡的影响（，n=9）Tab.2 Effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+HG-L group，3）P<0.05；com⁃pared with LPS+HG-M group，4）P<0.05.

Bax protein 0.28±0.02 0.74±0.051）0.61±0.052）0.47±0.032）3）0.34±0.032）3）4）224.823 0.000 Groups Con LPS LPS+HG-L LPS+HG-M LPS+HG-H F P Apoptosis rate（%）6.17±0.57 26.82±2.191）20.01±1.582）16.05±1.312）3）9.52±0.612）3）4）314.546 0.000 Bcl-2 protein 0.62±0.04 0.12±0.021）0.25±0.022）0.37±0.032）3）0.53±0.042）3）4）378.092 0.000

图1 哈巴苷对LPS诱导的hPDLCs凋亡的影响Fig.1 Effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs

2.3 哈巴苷对LPS 诱导的hPDLCs 中miR-1246 表达的影响 与Con 组比较，LPS 组miR-1246 表达水平升高（P<0.05）；与LPS 组比较，哈巴苷低、中、高浓度组miR-1246 表达水平降低，且呈浓度依赖性（P<0.05，表3）。

表3 哈巴苷对LPS 诱导的hPDLCs 中miR-1246 表达的影响（，n=9）Tab.3 Effect of harpagide on expression of miR-1246 in hPDLCs induced by LPS（，n=9）

表3 哈巴苷对LPS 诱导的hPDLCs 中miR-1246 表达的影响（，n=9）Tab.3 Effect of harpagide on expression of miR-1246 in hPDLCs induced by LPS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+HG-L group，3）P<0.05；com⁃pared with LPS+HG-M group，4）P<0.05.

miR-1246 1.00±0.07 3.22±0.271）2.48±0.212）1.89±0.162）3）1.38±0.132）3）4）213.170 0.000 Groups Con LPS LPS+HG-L LPS+HG-M LPS+HG-H F P

2.4 抑制 miR-1246 表达对 LPS 诱导的 hPDLCs 炎症因子表达的影响 与LPS+anti-miR-NC 组比较，LPS+anti-miR-1246 组 miR-1246 表达水平及 TNF-α、IL-1β水平降低（P<0.05，表4）。

表4 抑制miR-1246 表达对LPS 诱导的hPDLCs 炎症因子表达的影响（，n=9）Tab.4 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on ex⁃pression of inflammatory factors in hPDLCs in⁃duced by LPS（，n=9）

表4 抑制miR-1246 表达对LPS 诱导的hPDLCs 炎症因子表达的影响（，n=9）Tab.4 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on ex⁃pression of inflammatory factors in hPDLCs in⁃duced by LPS（，n=9）

Note：Compared with LPS+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

IL-1β（ng/ml）13.64±1.23 4.37±0.351）21.746 0.000 Groups LPS+anti-miR-NC LPS+anti-miR-1246 t P miR-1246 1.00±0.05 0.28±0.031）37.044 0.000 TNF-α（ng/ml）9.92±0.57 5.75±0.371）18.409 0.000

2.5 抑制 miR-1246 表达对 LPS 诱导的 hPDLCs 凋亡的影响 与LPS+anti-miR-NC 组比较，LPS+antimiR-1246 组细胞凋亡率降低，Bcl-2 表达水平升高，Bax表达水平降低（P<0.05，图2、表5）。

表5 抑制miR-1246 表达对LPS 诱导的hPDLCs 凋亡的影响（，n=9）Tab.5 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on apoptosis of hPDLCs induced by LPS（，n=9）

表5 抑制miR-1246 表达对LPS 诱导的hPDLCs 凋亡的影响（，n=9）Tab.5 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on apoptosis of hPDLCs induced by LPS（，n=9）

Note：Compared with LPS+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Bax protein 0.75±0.05 0.42±0.041）15.461 0.000 Groups LPS+anti-miR-NC LPS+anti-miR-1246 t P Apoptosis rate（%）28.15±2.57 11.89±1.051）17.571 0.000 Bcl-2 protein 0.11±0.02 0.51±0.041）26.833 0.000

图2 抑制miR-1246 表达对LPS 诱导的hPDLCs 凋亡的影响Fig.2 Effect of inhibiting expression of miR-1246 on apoptosis of hPDLCs induced by LPS

2.6 miR-1246 过表达逆转了哈巴苷（80 μmol/L）对LPS 诱导的hPDLCs 损伤的作用 与LPS+HG+miR-NC 组比较，LPS+HG+miR-1246 组 miR-1246 及TNF-α、IL-1β 水平升高，细胞凋亡率升高，Bcl-2 表达水平降低，Bax表达水平升高（P<0.05，图3、表6）。

表6 miR-1246过表达逆转了哈巴苷对LPS诱导的hPDLCs损伤的作用（，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-1246 reversed effect of harpagide on LPS-induced hPDLCs damage（，n=9）

表6 miR-1246过表达逆转了哈巴苷对LPS诱导的hPDLCs损伤的作用（，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-1246 reversed effect of harpagide on LPS-induced hPDLCs damage（，n=9）

Note：Compared with LPS+HG+miR-NC group，1）P<0.05.

Bax protein 0.32±0.02 0.64±0.041）21.466 0.000 Groups LPS+HG+miR-NC LPS+HG+miR-1246 t P miR-1246 1.00±0.06 2.38±0.211）18.956 0.000 TNF-α（ng/ml）4.66±0.36 8.24±0.561）16.133 0.000 IL-1β（ng/ml）3.19±0.22 9.71±0.511）35.216 0.000 Apoptosis rate（%）8.91±0.85 21.23±1.921）17.602 0.000 Bcl-2 protein 0.55±0.04 0.21±0.021）22.808 0.000

图3 miR-1246 过表达逆转了哈巴苷对LPS 诱导的hP⁃DLCs凋亡的作用Fig.3 Overexpression of miR-1246 reversed effect of harpagide on LPS-induced apoptosis of hPDLCs

3 讨论

牙周病是一种牙周组织破坏的炎症性疾病，而LPS 可引发牙周组织损伤，诱发炎症因子的释放从而导致牙周炎的发生［8-9］。因此，本实验用LPS 处理hPDLCs，结果显示，LPS 诱导的 hPDLCs 中 TNF-α、IL-1β 水平升高，细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax 表达水平升高；TNF-α、IL-1β 是促炎细胞因子，牙周炎中TNF-α、IL-1β 高表达［10］；表明LPS 可促进hPDLCs 中炎症因子的释放和细胞凋亡，诱导了hPDLCs 损伤。研究报道哈巴苷通过降低神经细胞凋亡，对急性脑缺血有保护作用［11］。哈巴苷可通过减少内质网应激来保护大鼠皮质神经元免受氧葡萄糖剥夺和复氧诱导的损伤［12］。为研究哈巴苷是否对hPDLCs 损伤有保护作用，本实验采用不同浓度的哈巴苷处理LPS 诱导的hPDLCs，结果显示，hP⁃DLCs 中 TNF-α、IL-1β 水平降低，细胞凋亡率降低，Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低，且呈浓度依赖性；表明哈巴苷剂量依赖的抑制LPS诱导hPDLCs凋亡和炎症因子的释放，对LPS诱导的hPDLCs损伤具有保护作用，提示哈巴苷有发展成为新型牙周病治疗药物的潜能。

研究报道miR-1246通过调节PKA和PP2A诱导间充质干/基质细胞的促炎反应［13］。lncRNA CAIF通过下调miR-1246 抑制LPS 诱导的骨关节炎CHON-001 细胞中 IL-6 上调［14］。lncRNA NEAT1 通过靶向miR-1246 诱导由NF-κB 介导的炎症因子的分泌，从而促进角膜新生血管形成进程［15］。以上研究表明miR-1246 参与调控细胞炎症因子的释放。本实验结果显示LPS 诱导的hPDLCs 中miR-1246 表达水平升高，抑制 miR-1246 表达后，LPS 诱导的 hPDLCs 中TNF-α、IL-1β 水平降低，细胞凋亡率降低，Bcl-2 表达水平升高，Bax 表达水平降低，表明抑制miR-1246表达可抑制LPS 诱导的hPDLCs 凋亡和炎症因子的释放。此外，本实验还发现哈巴苷处理后的hPDLCs中miR-1246 表达水平降低；而miR-1246 过表达逆转了哈巴苷对LPS 诱导的hPDLCs 损伤的作用。提示，哈巴苷可调控的miR-1246表达。

综上所述，哈巴苷可通过抑制miR-1246 表达抑制LPS诱导的hPDLCs凋亡和炎症因子的释放，从而保护hPDLCs免受LPS诱导的损伤。