血清miR-23a表达水平与急性脑梗死患者预后的相关性

王 鑫，薛 莉，崔长富，燕 飞，张 妮，李转会

(中国兵器工业五二一医院神经内科,西安 710065)

老年人易患多种脑血管疾病，随着我国老龄化人口的不断增加，这些疾病的发病率逐渐上升，尤其是急性脑梗死[1]。急性脑梗死的发生主要是由于一系列血液循环障碍，导致脑缺血坏死或脑组织软化[2-3]。急性脑梗死的发病率很高，发病后若不及时有效治疗，病情发展迅速，病死率较高[4]。虽然CT和MRI对急性脑梗死有较高的诊断价值，但应用血清学指标仍是预测和诊断急性脑梗死的理想方法[5]。 MicroRNA(miR)是一类小的非编码RNA，其主要功能是调节基因表达，几乎参与了器官形成、造血、细胞增殖和凋亡、肿瘤等所有生物过程[5-6]。miR在心血管疾病的病理生理调节中发挥重要作用，其与脑缺血再灌注损伤有关，也与神经元细胞凋亡有关[7]。因此，血清中miR可能作为急性脑梗死的生物标志物。研究发现了一些脑特异性的miR，通过比较胚胎神经细胞和星形胶质细胞培养中的表达，miR-23被证实具有星形胶质细胞特异性[8]。有研究[9]表明，miR-23a能减轻大脑中动脉缺血再灌注损伤大鼠的氧化应激反应。本研究收集本院临床患者的资料观察急性脑梗死患者血清中miR-23a的表达及其与病情严重程度的关系，探讨其对3个月预后的相关性，为急性脑梗死的诊断和治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2020年1月期间中国兵器工业五二一医院神经内科住院的急性脑梗死患者160例作为研究组，收集同期于本院进行健康体检的非脑梗死患者120例为对照组。研究组纳入标准：1)急性脑梗死患者均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》中关于急性脑梗死的诊断标准，经头颅MRI或头部CT检查确诊；2)首次发病，发病时间不超过72 h；3)患者年龄不小于18岁；4)无严重心肺肝肾功能不全者；5)自愿参加本研究并签署知情同意书。非脑梗死对照组患者经头颅MRI或头部CT检查排除急性脑梗死灶和陈旧性梗死灶。所有研究对象的排除标准：1)既往有急性脑梗死病史或外伤性急性脑梗死患者；2)有精神疾病患者；3)恶性肿瘤或自身免疫性疾病患者；4)有认知障碍者(蒙特利尔认知量表对患者的认知功能进行评估,若患者的受教育年限≤12年则加1分,评分≥26分为正常,若评分<26分为障碍)；5)临床资料不完整患者。本研究经本院伦理委员会批准，所有纳入研究的患者均签署知情同意书。

1.2 miR-23a的测定

住院患者入院后第2天清晨空腹抽取肘静脉血约4 mL，立即用离心机3500 r·min-1离心15 min，吸取上清液置于-20 ℃冰箱保存。所有标本收集完毕后，向200 μL上清液中加入1 mL Trizol裂解液室温裂解5 min。然后加入200 μL氯仿，室温放置15 min，用超速低温离心机12 000 r·min-1，4 ℃离心15 min。吸取上层水相加入等体积异丙醇，过夜沉淀。离心机12 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，倒掉上清，用1 mL 75%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，8000 r·min-1，4 ℃离心5 min，重复操作2次，晾干沉淀。用适量DEPC处理的水溶解RNA。用Nanodrop2000测定总RNA 浓度。然后使用逆转录试剂盒( 购于TAKARA中国公司) 将总RNA进行逆转录，得到模板单链cDNA。然后使用 qPCR试剂盒(购自东洋纺生物科技有限公司)对cDNA 进行实时荧光定量PCR。miR-23a引物F:CCGCCGGGATCCACGGCGGGCTGGGGTTCC。R:CCGCCGAAGCTTCAGAGCTCAGGGTCGGTTGG；用U6作内参，U6引物F:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT。R：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。按照TOYOBO One-step RT-PCR 试剂盒说明书配制10 μL体系，反应条件：90 ℃ 30 s →60 ℃ 30 min →94 ℃ 1 min→(94 ℃ 30 s → 60 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min)×40循环→72 ℃ 1 min，收集荧光信号。每个样品做3个平行孔。mRNA的表达量采用2-△△CT表示，其中△CT=(miR-23a平均CT)-(U6平均CT)，△△CT为(研究组miR-23a的△CT)-(对照组miR-23a△CT)，CT值为荧光信号在每个PCR管内到达设定阈值的循环数。

1.3 观察指标

收集所有入组患者的临床资料，包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史、疾病史(高血压、高脂血症、糖尿病、房颤史)等。入院治疗48 h后根据美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS评分)进行入院评分[10]。患者出院后3个月采取电话或者门诊复诊方式回访，根据改良Rankin量表进行评分，mRS≤2分为预后良好，mRS>2分为预后不良[11]。

1.4 统计学方法

数据均采用SPSS23.0软件进行统计分析。计量资料采用t检验。定性资料采用χ2检验。采用多因素logistic回归分析预后的影响因素；采用ROC曲线下面积(AUC)评估血清miR-23a对脑梗死预后的预测价值，计算约登指数确定最佳截断值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

对照组和研究组年龄、性别、吸烟史、饮酒史和糖尿病、房颤患病史均无明显差异(P>0.05)。研究组高血压、高脂血症患病史和NIHSS评分均升高，血清miR-23a表达水平低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 对照组和研究组临床资料比较 n,%

2.2 脑梗死严重程度与miR-23a表达的相关性

将NIHSS评分和脑梗死患者血清中miR-23a的表达水平进行Spearman相关性分析。结果显示，脑梗死患者血清中miR-23a表达水平与NIHSS评分呈负相关(r=-0.52，P=0.037)。

2.3 脑梗死患者预后的影响因素

对出院3个月的患者进行电话随访，其中有13例患者没有随访成功。其余147例根据改良Rankin量表进行评分，预后不良组(n=63)高血压、高脂血症、房颤史和NIHSS评分均高于预后良好组(n=84)，血清miR-23a表达水平低于预后良好组(P<0.05)，其余因素比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4 影响急性脑梗死患者3个月预后因素的多因素Logistic回归分析

对表2中有统计学意义的影响因素进行多因素Logistic回归分析，结果显示，入院NIHSS评分是急性脑梗死预后不良的独立危险因素(OR=6.526，P<0.05)，血清miR-23a是急性脑梗死预后的保护因素(OR=6.884，P<0.05)。见表3。

表2 预后良好组和预后不良组预后因素的比较 n,%

表3 急性脑梗死患者3个月预后相关因素Logistic回归分析

2.5 NIHSS评分和血清中miR-23a对脑梗死预后的预测价值

NIHSS评分和血清中miR-23a的表达水平对脑梗死预后预测均具有一定的预测价值，两个指标联合检测预测脑梗死预后具有较高价值，ROC曲线下面积AUC为0.963(95%CI：0.924～0.985)，灵敏度和特异性分别为90.48%和91.67%，准确性为91.16%。见表4和图1。

表4 NIHSS评分和血清中miR-23a对脑梗死的预测价值

图1 NIHSS评分和血清中miR-23a预测脑梗死预后的ROC曲线

3 讨论

大部分急性脑梗死始于脑血流中断，导致氧和葡萄糖供应严重受限，引发兴奋性毒性、钙失调、氧化应激和炎症等一系列病理反应，最终导致细胞凋亡和组织坏亡[12-13]。氧化应激与活性氧的不断增加有关，严重影响脑缺血/再灌注损伤的发病机制[14]。非编码RNA是一类遗传、表观遗传学和翻译调控因子，由microRNAs(miRNAs)、长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)和环状RNA(circRNAs)组成，它们通过控制转录和翻译发挥着重要的生理和病理作用[15-16]。miRNA是长度为21～25个核苷酸的小分子，是一种丰富且进化保守的内源性lncRNA。它们通过不完全或接近完美的碱基配对抑制和降解各自的mRNA，主要是在目标mRNA的3′未翻译区(UTR)[17-18]。多种miRNA(miR-146a、miR-155、miR-9、miR-23a、miR-424等)在脑缺血性卒中的诊断、预后预测中的作用已经被报道[19]，miRNAs作为疾病的生物标记被广泛研究。过表达miR-23a通过抑制凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)表达减轻神经元凋亡，miR-23a可以抑制多种细胞凋亡，提高细胞活性并减少脑梗死面积[20]。本研究结果亦显示，与对照组相比，急性脑梗死患者除了高血压、高脂血症患病史比例和NIHSS评分升高以外，血清miR-23a表达水平降低。

NIHSS可以在急性脑梗死早期对患者病情进行评估，通常入院治疗24 h后至5～7 d均可进行评估[21]。根据NIHSS评分对患者病情严重程度进行评分。本研究中Spearman分析结果表明NIHSS评分与血清miR-23a表达水平呈负相关(r=-0.64，P=0.041)。提示血清miR-23a表达水平对急性脑梗死严重程度有重要的提示意义。miR-23a在不同类型的细胞(包括间充质干细胞、内皮细胞、成骨细胞和肿瘤细胞)中起抗凋亡和促生长因子的作用。凋亡相关基因caspase-7、caspase-3、Fas、IRF1、Apaf-1被证实为其靶基因[9]。本研究结果显示，急性脑梗死预后不良组血清中miR-23a表达水平低于预后良好组，脑梗死会造成神经元损伤，miR-23a作为抗凋亡因子对神经元起了保护作用。预后不良组外周血miR-23a表达较预后良好组明显降低，提示miR-23a可能参与了急性脑梗死的病理过程。

脑梗死预后不良组和预后良好组的高血压、高脂血症和房颤病史也有差异。进一步用Logistic回归分析验证与急性脑梗死患者预后密切相关的因素。结果表明，入院血清miR-23a表达水平和NIHSS评分与急性脑梗死患者预后存在密切相关关系。NIHSS评分反映脑梗死的严重程度，脑梗死程度越严重患者预后越差，血清中miR-23a表达水平越高，患者预后越好，表明miR-23a对脑梗死预后起神经保护作用。本研究拟采用ROC曲线评估血清miR-23a和NIHSS评分对脑梗死预后情况的预测价值，发现上述两指标均能有效预测脑梗死发生，并且联合检测的预测价值最高，ROC曲线下面积AUC可达0.963，灵敏度、特异性分别为90.48%、91.67%，准确性为91.16%，建议临床定期监测急性脑梗死患者血清miR-23a和NIHSS评分，从而为制定早期干预措施改善患者预后提供指导。

综上所述，急性脑梗死预后不良的患者血清中miR-23a表达水平较预后良好者降低，miR-23a表达水平与急性脑梗死严重程度呈负相关，NIHSS评分和血清miR-23a对脑梗死预后均具有一定的预测价值，两者联合检测对脑梗死患者预后有一定指导意义。