利用RNA-seq技术分析有机磷农药作用下雄性小鼠睾丸组织差异表达基因

包玉龙，董 超，刘嘉琦，周好乐

（内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010010）

有机磷农药可防止植物产生病虫害，确保农作物高产、稳产，在农业生产中发挥着重要作用。但农药也可通过食物、环境暴露及职业接触等途径进入人体，导致急性或慢性中毒[1-3]。虽然国内外有关有机磷农药中毒机制的研究很多，但是对有机磷农药中毒发生在基因水平的改变的研究甚少。已有的有机磷农药对雄性动物生殖影响的研究主要集中在生殖毒性作用方面，这些毒性作用主要表现为精液质量下降、增加精子畸形率、降低精子活率和数量等[4-21]。

该试验利用转录组测序技术（RNA-seq）分析有机磷农药作用下雄性小鼠睾丸组织差异表达基因，为探索有机磷农药引起雄性小鼠生殖毒性的分子机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 有机磷农药的筛选。选择最常用的并已表现出毒性作用的有机磷农药DDV。

1.1.2 动物分组。选择40只昆明种雄性小鼠，随机分为对照组和低剂量染毒组、中剂量染毒组、高剂量染毒组。低、中、高剂量染毒组染毒剂量依次为5.0 mg/kg/d、10.0 mg/kg/d和20.0 mg/kg/d。染毒60 d后，以脱颈臼法处死小鼠，采集睾丸组织。

1.1.3 试验方法。使用天根Total RNA提取试剂盒提取各组小鼠睾丸组织Total RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检查；NanoPhotometerspectrophotometer检测RNA纯度(OD260/280 及 OD260/230 比值)；Qubit2.0 Fluorometer：RNA浓度精确定量；利用真核生物大部分mRNA都带有polyA尾的结构特征，通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA进行文库构建，开展Illumina HiSeq转录组测序分析。

2 试验结果

2.1 Total RNA的提取与鉴定

对提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果如图1。结果显示，每组提取出了18S和28SRNA。NanoPhotometer spectrophotometer检测RNA纯度(OD260/280及 OD260/230比值)。Qubit2.0 Fluorometer：RNA浓度精确定量结果如表1所示，均达到建立文库标准。

图1 各组DDV染毒小鼠睾丸Total RNA琼脂糖凝胶电泳图

表1 各组样品的浓度及纯度

2.2 高通量测序及数据分析

illunina高通量测序仪下机的数据通过测序错误率检查、GC含量分布检查及原始数据过滤，获得后续分析使用clean reads的数据汇总如下：

对照组和三个染毒组的转录组测序数据的解读分析结果显示，低剂量染毒组有46个差异表达基因，其中表达上调的有29个基因，表达下调的有17个基因（见图2）；中剂量染毒组有117个差异表达基因，其中表达上调的有36个基因，表达下调的有81个基因（见图 3）；高剂量染毒组有 117个差异表达基因，其中表达上调的有36个基因，表达下调的有81个基因；3种剂量染毒组共有的差异表达基因有7个，并且这7个基因的表达量都下调 （见图4）。共有的7个基因分别为：Gm14332、Gm6768、Ibs p、4930568A12R ik、Spin2g、RP23-328F4.6和Gm18849（见图 5）。

图2 低剂量染毒组与对照组间的差异表达基因维恩图

图3 中剂量染毒组与对照组间的差异表达基因维恩图

图4 高剂量染毒组与对照组间的差异表达基因维恩图

图5 三个染毒组与对照组相比较共有的差异表达基因

3 讨论与小结

目前，关于有机磷农药对雄性动物生殖影响的研究主要集中在生殖毒性作用方面。例如，叶劲松等人[7]用马拉硫磷染毒雄性小鼠，证明一定剂量的马拉硫磷可增高小鼠精子的畸形率。黄斌等人[15]证明，甲基对硫磷能够阻滞大鼠生精细胞的细胞周期进程，诱导生精细胞凋亡。于燕等[16]用敌敌畏、乐果和马拉硫磷混配后染毒雄性小鼠，结果显示，睾丸及附睾发生明显的病理学变化，各染毒组小鼠的精子活动率显著降低，精子数量显著减少，精子畸形率显著增高。何军山[17]、周好乐[18,19]等的研究均证明敌敌畏和敌百虫可增加小鼠精子的畸形率，具有明显的生殖毒性效应，但就有机磷农药对雄性动物产生生殖毒性效应的分子机制仍不十分清楚。该试验利用转录组测序技术 （RNA-seq）分析了有机磷农药作用下雄性小鼠睾丸组织差异表达基因，以期为探索有机磷农药引起雄性小鼠生殖毒性的分子机制打下基础。

转录组是指在特定条件下细胞或组织中所有的mRNA的集合。转录组学能够从整体水平上揭示特定生物学过程及疾病发生中的基因表达变化，从而了解其分子机制。RNA-Seq测序技术是指解读细胞或组织内mRNA、miRNA序列，对RNA的表达量进行定量、发现新的转录本的一种技术。RNA-seq测序技术已经成为基因表达分析最为敏感的工具之一。

本试验结果显示，低剂量染毒组有46个差异表达基因，其中表达上调的有29个基因，表达下调的有17个基因；中剂量染毒组有117个差异表达基因，其中表达上调的有36个基因，表达下调的有81个基因；高剂量染毒组有117个差异表达基因，其中表达上调的有36个基因，表达下调的有81个基因；3种剂量染毒组共有的差异表达基因有7个，并且这7个基因的表达量都下调。共有的7个基因分别为：Gm14332、Gm6768、Ibsp、4930568A12Rik、Spin2g、RP23-328F4.6和 Gm18849。