载阿霉素上转换纳米颗粒体内急性毒性实验研究

程梓荷　李科

1研究背景

随着科学技术的进步和医疗水平的突飞猛进，许多疾病的威胁已经大大降低，然而恶性肿瘤仍为全世界严重危害人类健康的一大类疾病之一。据世界卫生组织国际癌症研究中心（IARC）2020年发布的报告，2020年约996万人死于癌症，其中中国癌症死亡人数约300万，占癌症死亡总人数30%，位居全球第一。据国家癌症中心2019年1月发布的统计数据显示，2015年我国总体恶性肿瘤发病率为285.83/10万例，其中死亡率为170.05/10万例。在过去的10余年，癌症负担呈持续上升态势，恶性肿瘤发病率每年保持约3.9%的增幅，死亡率每年保持2.5%的增幅。目前临床上恶性肿瘤的治疗方式主要为放疗、化療、手术治疗三种，传统的治疗方法均存在不同程度的副作用，例如术后并发症、正常细胞组织损害、免疫力低下等，可降低恶性肿瘤生存者的远期生活质量和生存期。近年来，分子靶向治疗、免疫治疗等新型肿瘤治疗方法的研究如火如荼，但尚未有突破性的革新。因此，急需开发一种新型高效且精准的恶性肿瘤治疗方法。

上转换纳米颗粒（Upconversion Nanoparticles，UCNPs）主要由氧化物、氟化物和卤氧化物等基质通过掺杂三价稀土离子构成，是一种低毒、稳定和发光寿命长的新型荧光探针，其避免了短波长激发光（通常为紫外线）产生自体荧光后对发射光检测的干扰，且因为波长较长，对生物组织的穿透能力大大加强而对正常组织无侵害性，可实现深部组织非侵入式探测和治疗。UCNPs还具有许多优越的性能：优异的光和物理化学稳定性;生物相容性好;激发光谱窄，检测灵敏度高;较高的成像信/噪比;光损伤效应低;发射光稳定性好、几乎无光漂白现象：通过掺杂不同的稀土元素产生不同的发射光，实现多色同时检测。这些独特的优点使UCNPs在光、电、磁及生物医学等多个领域迅速成为研究人员关注的焦点。目前，针对UCNPs在恶性肿瘤治疗与诊断方面的主要研究方向为光动力治疗、光热疗法、化学联合疗法、多模成像指导的诊疗一体化等。其中，因UCNPs和化学药物的联合应用可有效提高药物靶向性、增强化疗效果，而具有更广阔的应用前景。

阿霉素及其生物活性衍生物作为临床上常用的抗肿瘤药物，可以直接导致细胞DNA损伤、活性氧的产生以及细胞凋亡，对乳腺癌、白血病等多种恶性肿瘤具有良好的治疗效果。但也因此不可避免地带来一系列抗癌不良反应，如心脏毒性反应、白细胞减少、血小板减少等，这不仅限制了其在肿瘤患者中的应用，还降低了肿瘤患者的预后。为了解决这个问题，人们将目光转向DOX与UCNPs的联合疗法，因为UCNPs不仅能实现光学成像，还可作为药物递送系统，实现定向给药，提高DOX治疗效果。

近些年来已有负载DOX的UCNPs对肿瘤细胞进行干预的研究报道，但尚未见体内急性毒性研究的相关报道。本研究利用制备的NaYF₄：Yb³⁺，Er³⁺@NaGdF₄@mSiO₂-FA-DOXNPs，进行BALB/c小鼠体内急性毒性实验及病理学变化分析，以评价其安全性，可为开发恶性肿瘤治疗新方法奠定理论基础并提供实验依据。

2研究方法

2.1材料

2.1.1动物

50只BALB/c小鼠，雌雄各半，体重（18±2）g，个体匀称、反应灵活、皮毛浓密、眼睛光泽、鼻孔清洁、无分泌物、呼吸正常，购自北京华阜康生物科技有限公司。将小鼠维持在标准环境下，室内温度21～25℃，相对湿度45%～55%，洁净饮食，安静通风清洁环境下分笼饲养，给予12h光照、12h黑暗循环。鼠笼为IVC鼠盒，鼠盒每次使用前应灭菌消毒，垫料每周更换2次，饲料和饮水每周添加、更换3～4次。动物饲养室保持清洁、干燥。所有实验程序均经西安医学院动物保护和使用委员会批准。

2.1.2药品和主要试剂

D0x购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NaYF₄：Yb³⁺，Er³⁺@NaGdF₄@mSiO₂-FA-DOX NPs由本实验室合成;苏木素-伊红（HE）染色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

2.2方法

2.2.1分组及给药

50只BALB/c小鼠随机分成5组，每组10只（雌雄各半），包括1个阴性对照组（生理盐水），1个游离DOX组（尾静脉注射给药，5.0mg/kg）和3个UCD NPs组（尾静脉注射给药，5.0mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg，以DOX计），给药后连续观察14d。

2.2.2一般体征

每天观察小鼠的一般体征、行为运动、精神状态和死亡等情况并记录小鼠质量。

2.2.3主要脏器HE染色

14d后将小鼠安乐死，取出心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，将脏器用4%多聚甲醛固定。经过修剪、脱水、透明、浸蜡、包埋后进行石蜡组织切片，切片厚度为4～6μm。HE染色时，首先用二甲苯脱去切片中的石蜡，将已人蒸馏水后的切片放人苏木素水溶液中染色数分钟，蒸馏水冲洗后用含1%盐酸乙醇分化数秒，0.6%氨水返蓝15min后流水冲洗，入伊红染液染色30s，染色后的切片经脱水、透明后固定封片，用光学显微镜观察。

3结果

3.1小鼠行为特征和体重变化

阴性对照组小鼠外观体征、行为活动、摄食量均正常。游离DOX组小鼠给药后出现懒惰、嗜睡、活动减少、厌食，立毛现象明显，个别出现黏液便，体重下降相对较快，死亡率为80%。UCD NPs组小鼠精神状态良好、活动自如、摄食量、粪便未见明显异常，体重有所下降，死亡率随DOX剂量增加而增加，死亡率依次为30%、40%和60%。

3.2小鼠各脏器病理变化

显微镜下观察发现，阴性对照组小鼠各脏器组织细胞完整，核清晰可见，细胞质丰富均匀，核膜清楚，无空泡化;游离DOX组小鼠心脏可见心肌细胞有不同程度的变性、坏死，心肌结构紊乱，肌纤维部分断裂，间隙扩大，间质内有淋巴细胞及浆细胞浸润，呈心肌炎表现：UCD NPs组小鼠仅表现为肝脏有轻微炎症细胞浸润，这是因为UCD NPs通过血液循环输送到肝脏组织中，被肝脏组织中的网状内皮系统中的巨噬细胞吞噬，从而导致其在肝脏中蓄积，引起正常肝细胞发生炎症反应。随着纳米颗粒逐渐被肝脏代谢，肝细胞即可恢复正常。

4讨论

恶性肿瘤是我国居民死亡的主要原因之一，虽然近年来其治疗取得了一定的进步，生存率有所提高，但常规疗法仍存在一定局限性，疗效尚不满意。随着纳米技术和生物医学的飞速发展，UCNPs的研究也愈发深入，其所具有的特殊的光学特性及良好的生物相容性等特点，为其构建成为抗肿瘤药物载体提供先决条件。UCNPs与化疗药物的联合疗法便是相关研究的热点内容之一。DOX作为一种临床常用的化疗药物，可被负载于UCNPs，得到的纳米颗粒可以降低DOX的不良反应、实现光学成像，具有广阔的临床研究前景。

现阶段UCNPs的相关研究尽管在体外毒性方面已有一定的成果，但是在纳米颗粒对动物器官的影响、纳米颗粒的体内急性毒性实验等方面仍需探索。因此，本实验通过制备的UCD NPs主要进行BALB/c小鼠体内急性毒性实验及主要脏器病理学变化的研究。研究结果表明，游离DOX组小鼠给药后大多数出现活动异常，体重下降快，死亡率较高。HE染色可见明显的毒性影响，表现为心肌纤维断裂，细胞间隙变大，心肌细胞发生变性坏死或有炎症细胞的浸润等改变。而UCD NPs组小鼠生命活动基本正常，药物毒性相对较小。UCD NPs组DOX剂量达到游离DOX组药物剂量的两倍时，死亡率仍低于游离DOX组;同等DOX浓度（5.0mg/kg）下，UCD NPs组的死亡率约为游离DOX组的1/3。由于纳米颗粒在肝脏的暂时性蓄积，在光镜下肝脏组织有少量炎性细胞浸润，其他脏器结构基本正常。

综上所述.本研究通过急性毒性实验发现UCD NPs可有效降低DOX的毒副作用，该研究结果可为日后的恶性肿瘤治疗临床新方法提供有效的参考。