光甘草定纳米脂质体的制备及甘油对其性能的影响

谭 沛， 张 辉， 胡 进， 刘 晨*

(1.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110；2.宁夏医科大学总医院，宁夏 银川 750004)

光甘草定是来源于豆科植物光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的异黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、神经保护、抗动脉粥样硬化、调节能量代谢等广泛的药理作用[1]，尤其是能有效抑制酪氨酸酶活性，在化妆品领域享有“美白黄金”之称[2]，将其用于治疗银屑病等常见皮肤病的相关研究[3]也日趋增加。但光甘草定水溶性低(25 ℃时仅为0.10 mg/L)，脂溶性强(logP=4.85)[4]，故如何改善其溶解性、提高其皮肤渗透性而获得理想的治疗或美肤效果引起了广泛关注。

目前，通常采用添加促渗剂[5]或新型纳米制剂技术(纳米乳[6]、脂质体[7-8]、纳米结晶[9]、环糊精包合物[10]等)等手段促进光甘草定透皮吸收，其中纳米脂质体不具有良好的皮肤相容性、渗透性、滞留性[11]，但不同脂质体配方可能影响其形态和性能，进而导致经皮渗透行为的差异[12]。甘油作为常见的外用制剂和化妆品添加剂之一，自身具有优良的保湿性能，但脂质体配方中添加该成分后对其成型和性能影响的报道较少。因此，本实验采用常见的薄膜分散法[13]制备光甘草定甘油脂质体，并考察处方中添加甘油与否对其载药、形态、透皮性能、体外抗氧化作用的影响，以期为相关后继产品研发奠定基础。

1 材料

1.1 试剂与药物 光甘草定原料药(纯度40%，南京景竹生物科技有限公司，JZ20140412)。蛋黄卵磷脂(上海太伟药业有限公司，20140518)；胆固醇(北京百灵威科技有限公司，LG50O54)；甘油(天津市大茂化学试剂厂，20141012)。其他试剂均为分析纯；水为纯化水。

1.2 仪器 细胞超声破碎仪(型号JY99-ⅡDN，宁波新芝生物科技有限公司)；旋转蒸发仪(型号THZ-100B，上海一恒科学仪器有限公司)；电子天平(型号ABS210S，德国Sartorius公司)；水浴锅(型号QL-861，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；高效液相色谱仪(型号Modl-L2000)、透射式电子显微镜(型号H-7650)(日本日立公司)；亚微粒径分析仪(型号Nicomptm 380，美国PSS公司)；药物透皮扩散试验仪(型号RYJ-12B，上海黄海药检仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 光甘草定纳米脂质体制备 称取光甘草定25 mg、卵磷脂300 mg、胆固醇40 mg，置于茄形瓶中，加入8 mL三氯甲烷，充分溶解后旋转蒸发仪挥干三氯甲烷，加入10 mL水性介质(处方A为纯水，处方B为10%甘油)水化30 min，35 ℃下搅拌1 h，400 W下超声处理5 min(每工作5 s停止2 s)，即得。

2.2 载药量、包封率测定 取适量纳米脂质体，置于10 mL量瓶中，加甲醇适量，超声提取20 min后甲醇定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，采用HPLC法测定光甘草定含量[9]，计算载药量。分析采用YMC-Pack Pro C18色谱柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)；流动相乙腈-0.44%冰乙酸(62∶38)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长282 nm。

另取适量纳米脂质体，置于离心管中，高速(16 000 r/min)离心15 min后取上清液，适当稀释作为供试品溶液，同法测定游离药物含量，计算包封率。结果见表1。由此可知，处方A、B载药量均约为2.5%，包封率均大于70%，大多数粒径在100～200 nm范围内，其中处方B载药量、包封率略低，粒子粒径大，但分布较窄。

表1 光甘草定纳米脂质体一般特性

2.3 形态、粒径表征 处方A、B经适当稀释后，分别采用激光粒度仪测定其平均粒径和多分散指数(PDI)，结果见表1。另将稀释后的纳米脂质体滴于300目铜网表面，1%磷钨酸溶液染色后通过透射电子显微镜(TEM)观察其形态和结构特征，结果见图1，可知处方A、B均呈不规则类球形的多层囊状体，粒径均小于200 nm，多数在100 nm左右，并且较为均匀。

图1 光甘草定纳米脂质体TEM图

2.4 大鼠离体皮肤透过性能研究 大鼠腹部皮肤指定区域利用剪刀、理发器除去毛发，涂擦10%硫化钠溶液脱去细毛[12-13]，立即用生理盐水反复清洗干净。24 h后处死，取下脱毛部位鼠皮，小心剥除皮下脂肪和结缔组织，生理盐水浸洗后备用。

离体皮肤透过性能采用Franze扩散池，在32 ℃、500 r/min下进行测试。将大鼠皮肤角质层向上，固定于接收池和扩散池之间，加入乙腈-pH7.4 PBS(40∶60)作为接收液[14]，将适量纳米脂质体均匀涂于大鼠皮肤表面，在预定时间点(l、2、3、4、6 h)各取样1.0 mL，立即补充等量同温接收液。

图2 光甘草定纳米脂质体累积渗透曲线

表2 光甘草定脂质体离体皮肤渗透系数

2.5 抗氧化活性研究 配制0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，密封避光保存备用，另配制0.5 mg/mL 维生素C溶液作为对照。取纳米脂质体溶液、DPPH溶液各2 mL，加到同一试管中，摇匀，室温下避光静置30 min后测定吸光度(A样品)；取维生素C溶液、DPPH溶液各2 mL，混合后测定吸光度(A对照)，计算清除率，公式为清除率=(1-A样品/A对照)×100%，结果见图3。由此可知，处方B对DPPH自由基的清除活性为68.7%，略高于处方A的60.6%，但清除率均低于维生素C的88.1%。

图3 光甘草定纳米脂质体的DPPH自由基清除率

3 讨论

在脂质体制备过程中，可加入表面活性剂、乙醇(或丙二醇)、挥发性萜类化合物、甘油等来制成相应传递体、醇质体、萜质体、甘油体等新型脂质体，提高其亲和力、变形性、稳定性，并进一步改善载体透皮促渗性能[15]。研究表明，某些中药活性成分(挥发油、冰片等)自身也能影响脂质体透皮性能[16]。

本实验在制备光甘草定脂质体时，加入了一定量甘油，发现包封率略有降低，其原因可能是甘油能一定程度上改善光甘草定在水性体系中的溶解度(该成分在甘油中的溶解度约为70 mg/g[14])，进而在脂质体成型过程中产生影响。体外透皮实验结果表明，甘油加入可提高脂质体给药后初期对皮肤的渗透能力，而给药1 h后光甘草定在离体鼠皮上的累积渗透率达3.73 μg/cm2，约为处方A的2倍，其原因可能与处方B所得制剂与皮肤亲和力、变形性的改善有关[8,17]，但这种渗透优势未能延续至后期，可能与该处方载药量较低有关。

综上所述，本实验采用薄膜超声法制得的光甘草定纳米脂质体粒径小而均匀，而甘油加入对其外观形态几乎无影响，但其载药特性、体外透皮、自由基清除率均存在一定差异。