基于网络药理学及分子对接研究栀子抗缺血性脑卒中的分子机制

孙 瑜， 蔡 媛， 沈冰冰， 李鹏辉， 邓天好， 彭艳梅

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006)

缺血性脑卒中是脑卒中的一种常见类型，占脑卒中总数的85%[1]，隶属于中医中风范畴。“毒损脑络”病机假说认为中风主要因为机体邪气郁积日久而化热，生风动血，以热毒侵犯脑络所致，主张以清热解毒法治疗中风[2-3]。栀子是茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的成熟果实，《神农本草经》记载栀子“味苦，性寒，主五内邪气，胃中热气”，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒之功效。现代药理研究表明，栀子具有抗炎、镇痛、保肝利胆、降血糖、降血压等作用[4]。近年来研究发现栀子在临床上治疗缺血性脑卒中应用广泛，含有栀子的中药复方有很多，如清开灵注射液[5]、醒脑静注射液[6]、天麻钩藤饮[7]、安宫牛黄丸[8]、黄连解毒胶囊[9]、治郁颗粒[10]等。目前关于栀子在缺血性脑卒中的药理作用研究开展比较广泛，大量研究表明栀子中活性成分对于缺血性脑卒中有预防和保护作用，其机制包括抗氧化应激[11]、抗凋亡[12]、保护血脑屏障等[13]。然而，这些研究都是单一或主要指标成分针对单一靶标或单一通路，对于栀子治疗缺血性脑卒中活性成分整体作用的分子机制还不明确。

网络药理学是建立在组学数据分析、虚拟计算及网络数据库检索基础上的生物信息网络构建及网络拓扑结构分析策略，其系统性与中医药的整体观相吻合[14]。近年来网络药理学在中药研究中的应用促进了中药从“单一靶点、单一成分”向“多靶点、多组分”的转变，为中药药效物质基础研究、阐述中药治疗作用整体机制提供了新手段。本文旨基于网络药理学和分子对接的方法分析栀子治疗缺血性脑卒中的分子机制，以期为后续实验研究提供理论参考。其具体流程分析见图1。

图1 栀子治疗缺血性脑卒中的网络药理学及分子对接分析流程图Fig.1 Network pharmacology and molecular docking flowchart of Gardeniae Fructus in treatment for cerebral ischemic stroke

1 方法

1.1 栀子中活性成分筛选和靶点预测 通过检索中药系统药理学数据库与分析平台 (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，以口服生物利用度(oral bioavailabity,OB)≥30%、类药性(drug-likeness,DL)≥0.18的2个药代动力学属性值进行栀子活性成分及其作用靶标筛选，并根据已发表的文献报道补充未预测到的活性化合物及其已知靶点。筛选结束后，在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)将化合物作用靶标进行基因名的转化和规范。

1.2 栀子治疗CIS相关靶点的获得 利用Gene Cards(https://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)数据库，以“Ischemic stroke”、“Cerebral ischemia”、“Cerebral ischemic stroke”为关键词进行检索，删除重复靶点，得到CIS发病过程已知靶点，在Uniprot数据库中将疾病基因靶点进行规范。利用Venny 2.1(http://bionfoggp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线工具绘制栀子活性成分与CIS相关靶点的韦恩图，并获得交集靶点。

1.3 “疾病-成分-靶点”网络模型的构建 将“1.1”“1.2”项下活性成分、靶点及疾病关系导入Cytoscape软件以完成相关网络构建，其中“节点”(node)表示药物、分子、靶点、疾病，“边”(edge)表示节点之间的关系。采用network analyzer插件进行网络特征分析，以度值(degree)大小反映节点大小，介数值(betweenness)反映边粗细，从而明确栀子中抗CIS较为重要的成分及相互作用力度。

1.4 栀子治疗CIS蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建 根据已经得到的疾病与栀子有效成分的交集靶点，利用STRING平台(物种选择Homosapiens)建立PPI网络，并导入Cytoscape软件中，通过网络拓扑分析得出度值(degree)和紧密值(combined scores), 以度值大小反映节点的大小和颜色，紧密值反映边的粗细和颜色，再利用MCODE插件和CytoHubba插件得出网络中连接最为紧密的子网络和核心靶点。

1.5 GO、KEGG富集分析 利用Metascape(https://metascape.org/)输入交集靶点，对GO Biological Process、GO Molecular Function、GO Cellular Component、KEGG Pathway进行全面富集，预测靶点的功能分布，设定P<0.01。

1.6 分子对接 从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中以物种选择为Homosapiens、蛋白分辨率为2.0～3.0为条件，搜索并下载血管内皮生长因子A(vascular endothelia growth factor A，VEGFA)、丝裂原激活蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、白细胞介素6(interleukin 6，IL6)的3D结构PDB格式文件。利用MOE软件对蛋白进行优化(去水、加氢、计算电荷、能量最小化等)后与从TCMSP中下载的小分子(mol 2格式)进行对接，选取结合能≤-5.0 kJ/mol[15]者作为栀子抗缺血性脑卒中的活性成分筛选依据。

2 结果

2.1 目标成分靶点预测 通过对TCMSP数据库中已报道的栀子成分及其药代动力学参数的相关检索，共搜集到活性成分98种。同时，根据OB和DL参数结合文献[16-19]对栀子活性成分进行筛选，共搜集到入血活性成分17种，见表1。利用相关靶点预测技术对上述活性成分进行作用靶点预测，排除重复靶点，并用Uniprot数据库对基因靶点进行规范，共获得预测靶点97个。

表1 栀子中活性成分

2.2 CIS相关基因及其与栀子活性成分相关的靶点 利用Gene Card、OMIM数据库，以“Ischemic stroke”、“Cerebral ischemia”、“Cerebral ischemic stroke”为关键词进行检索，分别发现4 333、101个靶点，删除重复靶点，在Uniprot数据库将疾病基因靶点进行规范，得到总靶点数4 409个。通过Venny 2.1在线工具绘制栀子活性成分靶点与CIS相关靶点的韦恩图，并得到交集靶点共80个，见图2。

图2 栀子活性成分靶点与缺血性脑卒中相关靶点的韦恩图Fig.2 Venn diagram of targets for active constituents of Gardeniae Fructus and cerebral ischemic stroke-related targets

2.3 “疾病-成分-靶点”网络模型 通过Cytoscape软件构建的网络共获得94个节点和237个关系，如表2、图3所示。

表2 栀子治疗缺血性脑卒中的活性成分

图3 “疾病-成分-靶点”网络图Fig.3 Disease-constituents-targets network diagram

2.4 蛋白相互作用网络构建与核心靶点筛选 蛋白互作网络(protein protein interaction network, PPI network)见图4A。由于PPI网络中蛋白质的相互关系复杂程度不同，存在着部分复杂程度较高的区域(dense regions)，是PPI网络中潜在的子网络，其连线密度较高，具有重要生物学意义，故再利用Cytoscape软件中的MCODE插件及过分子复合物检测算法对相互作用关系进行分析，比较score大小得到region，见图4B。为了更加精确地找到栀子抗缺血性脑卒中的核心靶点，通过CytoHubba插件进行MCC运算，得到核心靶点，其中前十个见图5。

图4 栀子-缺血性脑卒中靶点PPI网络(A)及其靶点子网络(B)Fig.4 Gardeniae Fructus-cerebral ischemic stroke stroke target PPI network(A) and its target subnet(B)

图5 按MCC法排名的前10个靶点Fig.5 Top 10 targets ranked by MCC method

2.5 GO、KEGG富集分析 Metascape平台拥有全面的注释功能，并且每月更新基因注释的数据资料[20- 21]，本研究采用该平台对栀子治疗缺血性脑卒中相关靶点进行信号通路分析，结果如图6所示。由此可知，栀子治疗缺血性脑卒中主要参与的生物学过程包括细胞对激素刺激的反应(cellular response to hormone stimulus)、对无机物的反应(response to inorganic substance)、对异源生物刺激的反应(response to xenobiotic stimulus)、对酮的反应(response to ketone)、细胞对氮化合物的反应(cellular response to nitrogen compound)、凋亡信号通路(apoptotic signaling pathway)。相关靶点治疗缺血性脑卒中的功能主要富集于转录因子结合(transcription factor binding)、核受体活性(nuclear receptor activity)、激酶结合(kinase binding)、激活转录因子结合(activating transcription factor binding)、泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin-like protein ligase binding)等。主要参与的细胞组分包括膜筏(membrane raft)、质膜蛋白复合物(plasma membrane protein complex)、转录因子复合物(transcription factor complex)等。

图6 GO功能分析Fig.6 GO function analysis

另外，栀子治疗缺血性脑卒中涉及的通路包括液体剪切应力和动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、MAPK、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、VEGF信号通路、血小板活化(platelet activation)等，见图7、表3。

图7 KEGG富集分析前20条通路Fig.7 Top 20 channels by KEGG enrichment analysis

表3 KEG富集分析结果

2.6 栀子有效成分与VEGFA、MAPK8、IL6的分子对接 将12种有效成分与核心靶点VEGFA、MAPK8、IL6所对应的蛋白复合晶体进行对接，结果见图8，可知VEGFA与亚油酸乙酯、藏红花酸、β-谷甾醇的结合能最小，MAPK8与京尼平苷、亚油酸乙酯、5-羟基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮的结合能最小，IL6与亚油酸乙酯、豆甾醇、京尼平苷的结合能最小。综上所述，MOL001494(亚油酸乙酯)、MOL001406(藏红花酸)、MOL000358(β-谷甾醇)、MOL004557(京尼平苷)、MOL003095[5-羟基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮]、MOL000449(豆甾醇)与VEGFA、MAPK8、IL6结合较好，其分子对接模型见图9。

图8 分子对接结果Fig.8 Results of molecular docking

图9 分子对接的最优复合结构及相互作用Fig.9 Optimal composite structures and interactions of molecular docking

3 讨论

本研究通过构建“疾病-成分-靶点”网络模型进行拓扑分析，共得到栀子治疗CIS的12个核心成分，即藏红花酸、京尼平、欧前胡素、栀子苷、苏丹红三、槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、亚油酸乙酯、5-羟基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮、异山柰素，这些化合物均有相关文献报道[22-25]，说明网络药理学研究方法中筛选参数及模型构建合理。根据degree值可知槲皮素、山柰酚作用靶点最多，说明槲皮素和山柰酚在栀子治疗CIS发挥重要作用。杨冉等[26]研究表明槲皮素通过氧化应激反应对脑缺血再灌注大鼠的血脑屏障具有保护作用。此外，山柰酚[27]可通过抑制TLR4和NF-κB来减少炎症因子TNF-α和IL-1β的水平从而改善大鼠脑缺血再灌注神经功能。

通过PPI网络拓扑分析，栀子治疗CIS的核心靶点包括VEGFA、MAPK8、IL6等。其中，VEGFA是一种促血管生成因子，主要富集于VEGF信号通路，David 等[28]研究发现，VEGFs在脑损伤和缺氧的双重刺激下，VEGF 能通过促进缺血半暗带内残存毛细血管内皮细胞的增殖和迁移来促进血管的新生。MAPK8是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[29]，该类激酶在脑缺血损伤中和缺血性神经元损伤中发挥重要作用。KEGG通路分析发现，栀子治疗CIS与液体剪切应力和动脉粥样硬化、MAPK、NF-κB、VEGF、血小板活化等信号通路相关，其大致可分为3个功能模块：①抗炎机制，其中NF-κB信号通路中的NF-κB为下端的关键分子，对炎性因子的转录表达起着直接调控作用，抑制NF-κB通路可以阻止促炎细胞因子的产生[30]。②动脉粥样硬化等血流速和血管相关机制。颅内动脉粥样硬化是CIS的常见诱因。晚期动脉粥样硬化会导致血小板活化、血管收缩、血栓形成，引发血流动力学，并导致CIS的形成。③综合调控机制，如MAPK信号通路，其主要由细胞外信号调节激酶1/2、氨基末端激酶、p38 MAPK 和细胞外信号调节激酶54条信号转导途径组成[31]。p38 MAPK通路中p38不仅参与炎症反应，还与缺血缺氧、炎症因子、内毒素、高渗透压、牵张和剪切应力等细胞应激时信号转导有关[32]。进一步选取PPI核心靶点VEGFA、MAPK8、IL6分别与12个核心成分进行分子对接，结果显示12个成分与3个靶点之间都有较好的结合能力，说明这12个核心成分可以直接与关键靶点相互作用，均为栀子治疗CIS的潜在成分。

综上所述，本研究以栀子为研究对象，通过网络药理学方法预测其治疗CIS潜在的作用成分、靶标及通路，并结合分子对接进一步验证成分与靶标的相互作用，从系统层面阐释了栀子治疗CIS具有多成分-多靶点-多通路的作用机制，为后续进一步探讨和实验设计的优化等提供了重要参考依据。