木犀草素固体脂质纳米粒的制备及其体内药动学研究

杨 娟， 尚曙玉， 贾 安， 郭锐税， 冯永豪

(1.黄河科技学院医学院，河南 郑州 450006；2.上海雷允上药业有限公司，上海 201401)

木犀草素属于黄酮类化合物，主要来源于白毛夏枯草、裸花紫珠、密蒙花、野菊花等植物中[1]，并且在洋葱、芹菜等蔬菜中也存在，具有神经保护、抗炎、保肝、抗肿瘤等药理作用[2-3]，研究价值较高。但该成分口服吸收较差，从而限制了其药效发挥及临床应用，故采用新型制剂技术改善其口服吸收生物利用度非常必要。目前，已有包合物、胶束、微乳等制剂学报道[4-6]，但缺少药动学研究。

固体脂质纳米粒是采用单一或混合脂质材料作为载体，将药物夹嵌或包裹在载体材料中制得的粒径在50～1 000 nm之间的胶粒给药系统[7-8]，促进药物口服吸收效果明显。本实验将木犀草素制成该剂型后，对其粒径、电位、药物存在状态、体外溶出进行研究，再考察其体内药动学，以期为该成分开发利用提供参考。

1 材料

XP205型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；DF-101S型磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；Vortex-2型涡旋振荡仪(上海沪析实业有限公司)；Nanosep©型超滤离心管(截留相对分子质量10 000，美国Pall公司)；DW-86L328型超低温冰箱(浙江捷胜低温设备有限公司)；FD-1A-80型冷冻干燥机(上海豫明仪器有限公司)；GY-GSDCY-24型氮气吹扫仪(上海归永电子有限公司)；LS13320XR激光衍射粒度分析仪(美国贝克曼公司)。

木犀草素对照品(批号111751-201812，纯度98.9%，中国食品药品检定研究院)；香叶木素对照品(批号P0587，上海源叶生物科技有限公司)；木犀草素原料药(批号P201005，纯度98.1%，北京索莱宝生物有限公司)；单硬脂酸甘油酯(批号1521489324-2)、泊洛沙姆188(F-68，批号1815004)(德国巴斯夫公司)；磷脂[PC-98T，辅必成(上海)医药科技有限公司]。

SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，体质量(300±20)g，动物生产许可证号SCXK(沪)2012-0003，于温度25 ℃、相对湿度55%的实验室中饲养1周后开始实验。

2 方法与结果

2.1 木犀草素固体脂质纳米粒制备 采用乳化蒸发-低温固化法。取20 mg木犀草素、150 mg单硬脂酸甘油酯、150 mg磷脂，置于20 mL乙醇中，在75 ℃水浴中磁力搅拌加热溶解，作为有机相；取0.8 g泊洛沙姆188、0.4 g聚山梨酯80，溶于40 mL蒸馏水中，于75 ℃水浴中磁力搅拌(转速1 000 r/min)加热溶解，作为水相，将有机相缓慢加到水相中，温度维持在75 ℃，持续磁力搅拌浓缩至25 mL，迅速置于-4 ℃冰箱中固化，即得。同法制备空白固体脂质纳米粒混悬液。

2.2 木犀草素含量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm)；流动相乙腈-四氢呋喃-0.1%磷酸二氢钾(70∶1∶29)；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长282 nm；进样量20 μL。

2.2.2 线性关系考察 称取木犀草素对照品20 mg，溶于100 mL乙腈中，混匀，得到贮备液(0.2 mg/mL)，取10 mL至100 mL量瓶中，乙腈-四氢呋喃-0.1%磷酸二氢钾(70∶1∶29)定容至20 μg/mL，稀释至10、5、1、0.1、0.05 μg/mL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以木犀草素质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=22.057 2X-1.078 6(r=0.999 8)，在0.05～20 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 方法学考察 取1 mL木犀草素固体脂质纳米粒混悬液，置于10 mL量瓶中，5 mL乙腈超声处理5 min后定容至刻度，6 000 r/min离心20 min，取上清液1 mL，置于10 mL量瓶中，乙腈-四氢呋喃-0.1%磷酸二氢钾(70∶1∶29)定容，得到供试品溶液，于0、2、6、12、24 h在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得木犀草素峰面积RSD为1.34%，表明溶液在24 h内稳定性良好。制备6份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得木犀草素含量RSD为1.52%，表明该方法重复性良好。取0.05 μg/mL(低)、5 μg/mL(中)、20 μg/mL(高)对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得木犀草素峰面积RSD分别为0.41、0.11%、0.12%，表明仪器精密度良好。取9份空白固体脂质纳米粒混悬液各1 mL，分别置于10 mL量瓶中，加入800 μg/mL对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL各3份，5 mL乙腈超声处理5 min后定容至刻度，6 000 r/min离心20 min，取上清液1 mL，置于10 mL量瓶中，乙腈-四氢呋喃-0.1%磷酸二氢钾(70∶1∶29)定容至刻度，取上清液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得木犀草素平均加样回收率分别为99.09%、98.83%、100.17%，RSD分别为1.11%、1.69%、0.85%。

2.3 包封率、载药量测定 取2.0 mL混悬液，置于量瓶中，5 mL甲醇超声处理5 min后定容至10 mL，在“2.2.1”项色谱条件下进样20 μL测定木犀草素总含量m总，另取2.0 mL混悬液至4 mL超滤离心管中(截留分子量为30 kDa)，10 000 r/min离心30 min，在“2.2.1”项色谱条件下进样20 μL测定游离药量m游离，计算包封率、载药量，公式分别为包封率=[(m总-m游离)/m总]×100%、载药量=[(m总-m游离)/(m总+m脂质)]×100%。结果，3批固体脂质纳米粒平均包封率为85.24%，载药量为5.24%。

2.4 形态观察 取木犀草素固体脂质纳米粒混悬液0.1 mL，加入4 mL蒸馏水混匀，滴于铜网上，2%磷钨酸染色，自然晾干，置于扫描电镜(TEM)下拍照，结果见图1。由此可知，所得纳米粒形状规整，呈类球形或球形，无粘连。

图1 木犀草素固体脂质纳米粒TEM图Fig.1 TEM image for luteolin solid lipid nanoparticles

2.5 粒径、Zeta电位测定 取木犀草素固体脂质纳米粒混悬液0.1 mL，加入4 mL蒸馏水混匀后置于比色皿中，测定粒径、Zeta电位，结果见图2～3，可知两者平均值分别为176.35、-33.8 mV。

图2 木犀草素固体脂质纳米粒粒径分布Fig.2 Particle size distribution of luteolin solid lipid nanoparticles

图3 木犀草素固体脂质纳米粒Zeta电位Fig.3 Zeta potential of luteolin solid lipid nanoparticles

2.6 冻干粉制备及其X射线粉末衍射(XRPD)研究

2.6.1 制备方法 取“2.1”项下木犀草素固体脂质纳米粒混悬液，以3%乳糖为冻干剂，混匀后密封，置于-70 ℃超低温冰箱中预冻2 d，迅速转移至冷冻干燥机中(-30 ℃)抽真空2 d，于6 h内匀速升温至25 ℃，取出，即得。复溶后，冻干粉平均粒径为236.81 nm，Zeta电位为-27.1 mV，包封率为78.85%，载药量为4.72%，木犀草素质量分数为0.85%。

2.6.2 XRPD 扫描条件为铜靶，管压40 kV，扫描范围3°～45°，扫描速度5°/min，分别对木犀草素、空白脂质纳米粒冻干粉、物理混合物(木犀草素+空白脂质纳米粒冻干粉)、木犀草素固体脂质纳米粒进行XRPD扫描，结果见图4。由此可知，木犀草素图谱中有许多晶体衍射峰，表明其存在状态为晶型；空白脂质纳米粒冻干粉也出现许多晶体衍射峰；物理混合物中仍可见在4.2°、9.3°处的特征晶体衍射峰；在木犀草素固体脂质纳米粒中未发现上述晶型衍射峰，表明木犀草素制成固体脂质纳米粒后的存在状态转变为无定型。

注：a～d分别为木犀草素固体脂质纳米粒、物理混合物、空白脂质纳米粒冻干粉、木犀草素。图4 各样品XRPD图Fig.4 XRPD patterns for various samples

2.7 体外释药研究 取木犀草素固体脂质纳米粒冻干粉1.4 g(含木犀草素10 mg)，加入3 mL溶出介质后转移至透析袋(截留分子量8 000～14 000 Da)中，两端扎紧。取木犀草素10 mg，同法制备对照品。以900 mL 1%SDS溶液为释放介质，温度、转速分别设置为37 ℃、100 r/min，于0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24 h各取样3 mL，取样后立即补加3 mL 1%SDS溶液，5 000 r/min离心10 min，取上清液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图5，可知原料药24 h累积溶出度仅为31.9%；固体脂质纳米粒释药过程分为快速释药期(前6 h)和缓慢释药期(6 h～24 h)，累积溶出度提高至71.5%。再分别采用Higuchi模型、Weibull模型、零级模型、一级模型对固体脂质纳米粒释药过程进行拟合，发现Weibull模型拟合度最佳，方程为lnln[1/(1-Mt/M∞)]=0.511lnt-1.336(R2=0.979 2)。

图5 木犀草素体外释药曲线Fig.5 In vitro drug release curves for luteolin

2.8 体内药动学研究

2.8.1 灌胃液制备 取木犀草素固体脂质纳米粒冻干粉0.53 g，0.5%CMC-Na溶液制成1.5 mg/mL混悬液(以木犀草素计)。取木犀草素5 mg，同法制成1.5 mg/mL混悬液。

2.8.2 分组、给药及血样采集 12只大鼠采用抛币法随机分为2组，按10 mg/kg剂量分别灌胃给予“2.8.1”项下2种灌胃液，乙醚麻醉后于0.15、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12 h立即眼眶取血适量(0.2～0.4 mL)，置于肝素润湿的离心管中，振荡后4 000 r/min离心2 min，取上层血浆，冷冻保存。

2.8.3 血浆样品处理 参考文献[4,9]报道，精密吸取血浆样品100 μL至离心管中，加入内标溶液50 μL、 HCl溶液(3 mol/L)200 μL，置于60 ℃水浴中1.5 h，加入150 μL 5%HClO4溶液，振荡10 min后加入2 mL乙酸乙酯，涡旋5 min，8 000 r/min离心20 min后取出，取上层有机相，45 ℃氮气吹干得残渣，加入100 μL流动相复溶。

2.8.4 内标、对照品溶液制备 称取香叶木素对照品10 mg，溶于100 mL乙腈中(100 μg/mL)，精密量取1 mL至100 mL量瓶中，乙腈定容混匀，精密吸取5 mL至10 mL量瓶中，即得500 ng/mL内标溶液。取“2.2.2”项下贮备液，乙腈依次稀释至1 500、750、300、100、20 ng/mL，即得对照品溶液。

2.8.5 专属性、线性关系考察 取1 500、750、300、100、20 ng/mL对照品溶液各100 μL，分别加入50 μL内标溶液，45 ℃氮气吹干得残渣，加入大鼠空白血浆100 μL，按“2.8.3”项下方法操作，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图6，可知该方法专属性良好。以木犀草素质量浓度为横坐标(X)，木犀草素、内标(香叶木素)峰面积比值为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=1.254 8X+0.102 2(r=0.991 2)，在20～1 500 ng/mL范围内线性关系良好。

1.木犀草素 2.内标(香叶木素)1.luteolin 2.internal standard (diosmetin)图6 木犀草素HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of luteolin

2.8.6 方法学考察 取处理后的血浆样品，于0、4、12、24、48 h在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得木犀草素、内标(香叶木素)峰面积比值RSD为1.75%，表明溶液在48 h内稳定性良好。以1 500、300、20 ng/mL血浆对照品溶液为高、中、低质量浓度，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得日内精密度RSD分别为6.11%、9.03%、10.56%，日间精密度RSD分别为8.92%、9.93%、11.05%，表明该方法精密度良好。取100 μL空白血浆，依次制成1 500、300、20 ng/mL溶液，在“2.2.1”项色谱条件下各进样测定3次，测得木犀草素加样回收率87.14%～97.09%，RSD为10.14%。取20 ng/mL血浆对照品溶液(不含内标)，逐步稀释后在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得定量限为5 ng/nL，检测限为 2 ng/mL。

2.8.7 结果分析 图7、表1显示，与原料药比较，固体脂质纳米粒tmax延长(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相对生物利用度提高至2.28倍。

图7 木犀草素血药浓度-时间曲线Fig.7 Plasma concentration-time curves for luteolin

表1 木犀草素主要药动学参数

3 讨论

木犀草素水溶性较低，会发生溶出速率及溶出度受限、脂溶性差、透膜吸收困难、在胃肠道中容易受到酶解等问题[9-10]，导致其口服吸收生物利用度不理想。本实验将该成分制成固体脂质纳米粒后，药物溶出速率、累积溶出度均得到提高，可能是由于它以无定型状态存在于纳米粒中，有助于溶解度提高；纳米载药系统使其比表面积明显增加，促进其快速溶出，增加其与胃肠道黏膜的接触面积[11-14]。另外，药物包裹于固体脂质纳米粒中时可避免与外界环境直接接触，降低被破坏几率，提高稳定性，同时纳米制剂可改善其渗透性[15]，促进透膜吸收。

文献[16]报道，木犀草素进入人体后可与血清蛋白相结合，故需使该成分从结合态游离出来。本实验分别采用HCl、HClO4溶液对蛋白进行水解、沉淀，并以乙酸乙酯提取，药动学结果显示，固体脂质纳米粒tmax延后，可能是由于纳米粒粒径较小，提高了与胃肠道黏膜的粘附性，增加了在胃肠道中的滞留时间，导致tmax延后；Cmax显著升高，可能与纳米粒特殊吸收机制有关，可使药物被高效吸收进入血液循环，从而提高其口服生物利用度[17-18]。但固体脂质纳米粒促进药物吸收的程度还会受到纳米粒粒径、纳米材料性质、表面活性剂种类、纳米粒表面亲水亲脂性及空间特性、体内稳定性及跨膜吸收过程中诸多因素的影响[13, 18-20]，今后尚需作进一步研究。