健康/根腐病黄连深色有隔内生真菌多样性研究及定殖调查

伍晓丽， 韩 娟， 刘 飞， 莫让瑜， 潘 媛， 陈大霞*， 王 钰

(1.重庆市中药研究院 种植研究所，重庆 400065；2.中国中医科学院 中药资源中心重庆分中心，重庆 400065；3. 中药资源学重庆市重点实验室，重庆 400065；4.重庆市中药研究院 大健康中心，重庆 400065；5.重庆科技学院，重庆 401331)

黄连(CoptischinensisFranch)又称味连，以根茎入药，是我国大宗、重要的药用植物。具清热泻火，燥湿解毒等多种功效，在很多中药配方中均有使用[1]。根腐病是近年来黄连生产中的重要病害之一，在四川、重庆、湖北等主要产区均有发生，造成了严重的经济损失。连农曾经使用多菌灵、百菌清等多种化学农药对该病进行防治，但效果不佳。深色有隔内生真菌(dark septate endophytes，DSE)是定居在植物根部与植物形成共生关系的一类真菌，在根内形成颜色深，有明显隔膜的菌丝和微菌核，这是DSE区别于其他内生真菌的重要特征。DSE菌落颜色多样，有浅灰、灰绿、褐色、深棕色、黑色等，有的菌株分泌深色色素[2-3]。DSE在植物中普遍存在，114科320属约600多种植物根部均发现DSE定殖，这些植物在高山、荒漠、极地、寒带、温带、热带等不同生境及极端环境地区均有广泛分布[4]。DSE的功能类似菌根，可以增强植物抗逆境能力，提高其对病虫害的防御能力，促进植物吸收和利用养分等，是目前研究的热点菌群[5-6]。因此，DSE被广泛应用于多种植物的抗病研究，张晓蓉等[7]发现DSE甘瓶霉Phialophoramustea可以显著缓解尖孢镰刀菌抑制番茄生长的症状；农倩等[8]筛选到1株DSE L-14，对香蕉枯萎病的防效达到72.4%；胡丽杰[9]从宁夏枸杞根部分离到镰刀菌属DSE菌株NQ8GII4，其发酵液对葡萄灰霉病的防效高达82.05%，与化学药剂腐霉利的效果相当。目前尚无黄连DSE的相关研究报道。前期研究发现，黄连根条中DSE菌株Cadophoraorchidicola的分离频率与根腐病有明显关系，健康根条中该菌分离频率高达20%，明显高于根腐病根条中该菌的分离频率1.52%。因此，本研究对健康/根腐病植株中DSE分离频率及多样性进行了进一步研究，并对重庆、四川、湖北等黄连主产区不同年生健康黄连DSE定殖情况进行了调查，以揭示DSE定殖与根腐病发生的关系及DSE的定殖情况，为利用DSE促进黄连生长发育，提高黄连抗逆抗病能力提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 ①DSE分离材料来源: 2018年9月在重庆石柱四个黄连主产地沙子镇、冷水镇、黄水镇、枫木镇，每地点选采样地2块(二年生、三年生黄连各1块)，每个地块按五点法分别采集二年生、三年生健康/根腐病黄连，每点1株，每个地块10株，每个地点20株，每个地点二、三年生的健康株10株混合成一个样品，病株10株混合成一个样品，共计8个样品。取回后立即进行DSE的分离和鉴定。采样点详细地理信息见表1。②DSE定殖情况调查材料来源:2019年6月在重庆、四川、湖北等黄连主产地区采集健康黄连进行DSE定殖情况调查统计。每个地区选择1块样地，按五点法采样，每个采样点4株，共计20株/样地。采样点详细地理信息见表2。

表1 石柱采样点地理信息

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(北京陆桥)。

1.1.3 试剂与仪器 B518259 Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工Sangon Biontech)；RR178 Fungi Identification PCR Kit (Takara)；FAA固定液[10]。超微量分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo Scientific)；水平电泳仪(DYY-6C，北京六一生物科技有限公司)； PCR仪(PTC-100，Bio-rad)；凝胶成像仪(Gel Doc XR，Bio-rad)；立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-75KB，上海申安医疗器械厂)；超净工作台(SW-CJ-1FD，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；生化培养箱(SPX-250，上海跃进医疗器械有限公司)[10]。

1.2 方法

1.2.1 深色内生真菌分离纯化 取健康和患根腐病的黄连须根，清水漂洗去泥土，洗衣粉水洗1 min，流水冲洗1 h,75%(体积分数)乙醇洗1 min,无菌水漂洗1次，无菌滤纸吸干，0.1%(质量分数)升汞灭菌2 min,无菌水清洗4次，无菌滤纸吸干，剪小段，接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基，20 ℃黑暗培养[10]3 d后，每天观察，挑取组织周围长出的真菌菌丝进行纯化培养，长成深色菌丝纯化后保存备用。

表2 采样点地理信息

1.2.2 深色内生真菌分子鉴定 ①真菌基因组DNA提取：采用柱式真菌基因组 DNA 抽提试剂盒，按照说明书操作提取基因组DNA，经超微量分光光度计检测DNA含量后进行PCR扩增。②ITS 序列PCR扩增：用RR178试剂盒扩增真菌ITS 序列。扩增体系(50 μL)：ddH2O 20 μL，PCR premix 25 μL，真菌DNA模板 4 μL，ITS1和ITS4 Primer 各0.5 μL。引物序列：ITS1为TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4为TCCTCCGCTTATTGAT-ATGCPCR。扩增条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环39次；72 ℃延伸 10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送华大基因公司测序[10]。

1.2.3 深色内生真菌离体回接 所有分离到的深色真菌，根据分子鉴定结果，同种的选1～2株菌进行离体回接，菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上25 ℃黑暗培养10～15 d至菌丝长满平皿。剪取健康黄连根条(长约3～4 cm)，无菌水清洗数次，无菌滤纸吸干水分，置于菌丝上共培养，4条根/皿，3皿/菌株，25 ℃黑暗培养10～15 d后观察统计发病情况。以水琼脂培养基培养的健康黄连根条作为对照[11]。

1.2.4 DSE显微观察 插片法对经过离体回接筛选出的疑似DSE菌丝进行显微观察是否有隔。

1.2.5 黄连根部DSE定殖情况调查 每块样地取黄连20株，每株上剪取1 cm长根条10条，于FAA固定液保存备用。实验前清水漂洗3～4次，10%(质量分数)KOH 90 ℃离解60 min，清水漂洗4～5次，乳酸中和后镜检。根样上滴清水1～2滴制片，电子显微镜下观察并拍照，每条根观察5个视野，记录每个视野中微菌核和DSE菌丝的定殖情况。使用SPSS 20 软件对黄连DSE定殖率和定殖强度进行比较。定殖率(%)=(定殖根段数/镜检根段总数)×100%，定殖强度(%)=(DSE感染视野数/总视野数)×100%[12]。

2 结果与分析

2.1 黄连根部深色内生真菌种属、离体回接结果及形态特征

经分子鉴定，从健康和患根腐病的黄连根部共计分离出深色内生真菌16株，属于10个属。其中6株离体回接表现致病性，不属于DSE。其余10株不致病，属于6个属，显微观察有隔，确认属于DSE(表3，图1、2)。

表3 黄连根部深色内生真菌分子鉴定结果和离体回接结果及形态特征

图1 深色内生真菌离体回接Fig.1 In vitro infection of dark endophytic fungiA、B：离体回接不致病的菌株 ；C、D：离体回接致病的菌株A，B：The non-pathogenic fungi； C，D：The pathogenic fungi

图2 部分DSE菌落形态和显微形态Fig.2 Morphology of DSEA、B、C、D：DSE菌落；E、F：类似微菌核结构；G、H：糖葫芦串结构；I、J、K、L：菌丝A，B，C，D：DSE colony；E，F：Structure similar tomicrosclerotia；G，H：String structure； I，J，K，L：Mycelium

2.2 健康/根腐病黄连根部DSE分离频率比较

无论是不同地方分别统计还是4个地点的总体统计，DSE的分离频率健康植株均高于根腐病植株。且二者的优势菌种不同。健康植株根部C.orchidicola为优势菌种。根腐病植株根部Ceratobasidiumsp. G3为优势菌种(表4)。

2.3 DSE菌核显微观察

黄连根部观察到大量DSE存在，DSE在黄连根内形成颜色深且有明显隔膜的菌丝和微菌核等典型结构。菌丝为浅褐至深棕色，微菌核由细胞壁增厚的膨大细胞聚集形成，且形态特征、发育程度不同。有的充满了整个细胞腔，有的尚在发育之中；有的深色或浅色；成串、成簇或单生。较多微菌核萌发,有的微菌核在根部表面萌发(图3)。

表4 健康/根腐病黄连根部DSE分离频率比较

图3 黄连根条中定殖的DSEFig.3 DSE colonizing in C. chinensis root A：浅色颗粒状微菌核；B：深色颗粒状微菌核； C：萌发的微菌核；D、E：菌丝形成的特殊结构；F：菌丝；G：不同形态的微菌核；H：根表面萌发的微菌核；I：串状微菌核A：Light-colored and grainy microsclerotia；B：Deep-colored and grainy microsclerotia； C：Germinating microsclerotia；D，E：Special structure of mycelium； F：Mycelium； G：Microsclerotia of different morphology； H：Microsclerotia germinating at root surface；I：Microsclerotia string

2.4 不同产地和年生黄连DSE定殖情况

不同产地的黄连DSE定殖率和定殖强度具有显著差异(P<0.05)，定殖率高的为重庆石柱横店村、石柱卧龙村、石柱河园村、开州姚程村、四川彭州春芽村，定殖率低的为四川洪雅黑林村、大邑江源村、什邡天桥村、湖北恩施太山庙村。定殖强度最高的为开州姚程村，最低为恩施太山庙村。不同年生的定殖率和定殖强度差异显著(P<0.05)，但定殖情况和年生没有明显关系(表5)。

表5 不同产地和年生黄连DSE定殖情况

3 讨 论

本研究发现黄连根部DSE普遍、大量存在，且菌核形态和发育程度具有多种类型，推测为不同种类真菌形成的菌核。分离结果也表明，黄连中DSE具有多样性。同种植物中DSE菌核形态和种类的多样性在其他植物中也很普遍，如蒙古沙东青[13]。

显微观察发现，有的DSE幼嫩菌丝膨大形成大量糖葫芦串状结构，颜色浅，随着菌龄增加，糖葫芦串状结构颜色变深，推测其聚集形成微菌核。有的DSE在PDA上已开始发育出微菌核结构，培养基上出现微菌核的现象其他文献也有报道[14]。本研究分离到的DSE在其他植物中也有定殖：Cadophorasp.是水生芦竹、野棉花等多种植物的DSE[15-16]；Leptodontidiumsp.是马耳草、银穗草等的DSE[16]。

DSE的分离频率，无论是不同地点的分离频率还是总的分离频率，健康根条均高于根腐病根条。且二者DSE种类和优势菌群均有差异。说明根腐病对DSE的定殖是有明显影响的。对健康和根腐病植物的有益内生真菌定殖情况的比较研究很少，张智慧等[17]发现丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi,AMF)浸染率健康三七明显高于根腐病三七，但二者根部DSE侵染率没有明显差别。是病原菌的入侵破坏了黄连DSE的定殖，还是根部DSE的失衡导致了病原菌的入侵，其因果关系有待深入研究。

很多文献把从健康根条中分离出的颜色深、有隔膜的内生真菌定义为DSE。本研究表明，即使在健康植株中，也能分离到病原真菌，如本研究从健康根条中分离到的Phomaherbarum、Phomasp. Sigrf24。前期研究从健康黄连根条中也分离到了Fusariumoxysporum，其分离频率达5.33%，但该菌是黄连根腐病重要致病菌之一，具有强致病性[11]。因此，本研究对健康根条分离出的深色有隔真菌均进行了离体回接，以筛除病原真菌。

不同年生和产地的黄连均有DSE定殖，但同样年生不同产地，同一产地不同年生黄连DSE定殖强度和定殖率有差异，且定殖率与年生没有明显的关系。这种现象在其他植物中也很普遍[18-19]，说明DSE的定殖受土壤肥力、耕作措施、气候环境等多种生态、人为因素的影响。

DSE对宿主的养分吸收、生长发育、抗病抗虫、逆境耐受、抗重金属能力均有促进作用[20-22]。黄连中DSE普遍大量存在，其对宿主抗逆抗病性影响及促生作用等均值得深入研究，可为DSE开发生产黄连微生物肥料提供参考。

很多DSE难以产生孢子，不能通过形态准确鉴定其种类[23]，因此，本研究未做形态鉴定。分子鉴定技术应用于 DSE可以对其进行大致的分类。