维生素D与早发性卵巢功能不全患者卵巢功能相关性的研究进展

张土砷，王芳

(广东省妇幼保健院生殖中心，广州 511400)

卵巢作为女性的生殖器官，是卵泡发育及成熟的场所。卵巢的主要功能是排卵及分泌性激素。女性在40岁之前发生卵巢功能减退(diminished ovarian reserve，DOR)称为早发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)综合征。<40岁女性临床出现停经、月经稀发>4个月、连续2次间隔4周以上血清FSH>25 U/L即可诊断为POI。POI的发病机制尚不明确，其主要的治疗方法是激素补充[1-2]。此外，前沿的治疗方法有干细胞移植、卵泡体外激活以及基因编辑等[3-5]，但目前，前沿的治疗方法仍处于研究阶段临床尚未普及。POI进程可分为4个阶段：正常期、隐匿期、生化异常期和临床发展期[6]。卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)为POI的终级阶段。POI不仅影响女性的生育能力，使女性提前进入更年期或出现性功能障碍，还增加了心血管、骨质疏松、抑郁等疾病的发生率，影响女性的生理及心理健康[7-9]。

维生素D(vitamin D，VD)是一种脂溶性甾体类激素的前体，VD有VD2和VD3两种形式，VD2主要由植物及真菌提供，VD3由肉类食物及人的皮肤合成。VD2和VD3由肝脏中的25-羟化酶(CYP27A1、CYP3A4和CYP2R1)作用形成25-羟基维生素D2[25(OH)D2]和25-羟基维生素D3[25(OH)D3]，两者统称为25-羟基维生素D[25(OH)D]。25(OH)D与维生素D结合蛋白(VDBP)形成复合物，该复合物在血液中被转运到肾脏，并由肾脏中的1α-羟化酶作用形成具有生物学活性的VD3，称为1，25-二羟维生素D3[1，25(OH)2D3]。VD通过与维生素D受体(VDR)结合并改变细胞核中靶基因转录从而发挥生物活性。VDR属于核受体家族，是由配体激活的转录因子。1，25(OH)2D3与VDR结合后与维甲酸受体(RXR)形成1，25(OH)2D3-VDR-RXR复合物，该复合物被转运到细胞核并与VD应答基因启动子区的维生素D反应元件(VDRE)结合。1，25(OH)2D3-VDR-RXR与VDRE结合后，通过抑制或启动靶基因的转录，从而改变VDR的潜在靶标基因的表达。25(OH)D的半衰期约为3周，其性质稳定且不受甲状旁腺激素的影响，而1，25(OH)2D3的半衰期约为4 h，因此临床上以血25(OH)D浓度衡量机体VD的储备情况[10-11]。

VD对于人类的健康尤为重要。VD的经典作用是调节血液与骨组织的钙磷平衡，缺乏VD时除了影响骨代谢，还会引起糖尿病、神经系统疾病、心血管系统疾病、免疫系统疾病、恶性肿瘤等多种疾病的发生[12]，此外，VD还参与调节女性生殖系统。Yoshizawa等[13]研究发现，雌性小鼠敲除VDR基因后小鼠的子宫发育不全、卵泡发育受损。Kinuta等[14]研究发现，小鼠敲除VDR基因后调控雌激素合成的细胞色素P450的活性及芳香化酶基因(CYP19)表达水平较野生型小鼠显著降低，血清LH和FSH水平较野生型显著升高，在补钙维持正常血钙浓度的情况下，卵巢CYP19的表达量可以增加到野生型的60%。VDR在卵巢、子宫内膜、胎盘和睾丸中都有表达，表明VD在这些组织中起着关键作用[15]。一项前瞻性研究发现，不孕症患者血清VD浓度与窦卵泡数具有相关性，严重缺乏VD时会影响患者的卵巢储备[16]。VD对于维持正常的卵巢功能是必不可少的。因此，本文将从卵泡的招募、卵泡的生长发育和卵巢的免疫性损伤等方面探讨VD与POI患者卵巢功能的相关性。

一、VD与卵泡的招募

卵巢的储备功能是由卵巢中始基卵泡的数量和质量决定，其反映女性的生育寿命。Zheng等[17]认为，始基卵泡发育有3种截然不容的命运：(1)卵泡保持静止；(2)卵泡被激活并生长，然后经历闭锁或直接完成其发育过程直至排卵；(3)卵泡直接凋亡。卵巢中只有约1/10～1/3的始基卵泡能被激活并开始生长最后形成初级卵泡，这一过程被称为原始卵泡初始募集。始基卵泡向窦前卵泡发育的过程不依赖促性腺激素，但需要卵母细胞和体细胞之间复杂的双向对话。原始卵泡初始募集可以提供精选的、成熟健康的卵母细胞，同时防止卵巢储备的过早衰竭，以确保生长卵泡池和静止卵泡池之间的持续平衡。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路参与了始基卵泡的激活。PI3K由p85调节亚基和p110催化亚基组成。p85调节亚基与胰岛素受体底物相互作用从而激活催化p110亚基，并诱导下游的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)磷酸化成为磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)，从而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路。人10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)是PI3K/Akt/mTOR通路的负调节因子[18-19]，PTEN通过将PIP3转化为PIP2来调控PI3K/Akt/mTOR信号通路。小鼠卵母细胞中PTEN的缺失使得始基卵泡过度激活，从而导致POF[20]。有研究发现，VD可以降低乳腺癌细胞中PTEN基因启动子的甲基化作用[21]。还有研究发现，VD可以上调肝癌细胞中PTEN的表达从而负向调控PI3K/Akt/mTOR信号通路来抑制细胞周期的进展[22]。以上研究表明，VD可能通过上调PTEN基因来抑制始基卵泡的过早激活，从而维持卵泡池的平衡，避免卵泡过度激活导致POI。

抗苗勒管激素(AMH)是由卵巢内窦卵泡周围的颗粒细胞产生的糖蛋白，属于转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)家族。AMH与特异性受体AMHR-Ⅱ结合来诱导细胞内Smad蛋白(1、5、8位点)的磷酸化，从而将信号传导至细胞核[23]。在人和牛卵巢的体外试验中，在不添加AMH情况下，始基卵泡的发育会被过度激活，在培养液中加入AMH后这种激活被抑制，表明AMH可以通过抑制始基卵泡向生长卵泡池的募集来防止卵泡池的早期消耗[24]。在性成熟的哺乳动物中，初级卵泡在激素的调控下，逐渐向次级卵泡、窦卵泡发育，最后形成优势卵泡并排出卵母细胞，这一过程呈现周期性，因此被称为卵泡的周期性募集。通常周期性募集只有一个优势卵泡排出，其余卵泡则进入闭锁阶段，闭锁阶段取决于卵泡对FSH的敏感性。AMH能够降低大窦前卵泡和小窦卵泡对FSH的敏感性来抑制卵泡的周期性募集[25]。Malloy等[26]研究发现，前列腺细胞中AMH基因的启动子区域上有VDR的反应原件(VDRE)，补充VD后AMH启动子区域的荧光素酶反应增强，VD与VDR结合后能够增强AMH启动子的活性。体外培养猕猴卵泡试验发现，补充VD能够促进血AMH的产生[27]。健康妇女短期大剂量服用VD后，血AMH浓度显著升高[28]。也有研究发现，血清和卵泡液VD<30 ng/ml时，AMH与VD之间呈负线性相关，而血清和卵泡液VD≥30 ng/ml时，AMH和VD的是正线性关系[29]，说明充足的VD可能是AMH的正向调节因子，VD缺乏时则抑制AMH的表达。一项非随机临床实验发现，对血AMH<0.7 ng/ml且VD<30 ng/ml的POI患者给予每周补充50 000 U VD，连续治疗3个月后患者血AMH水平显著升高[30]，表明补充VD能够改善POI患者的卵巢功能。

二、VD与卵泡的生长发育

为了更直观验证VD对卵泡生长的影响，Xu等[27]研究发现，在恒河猴的窦卵泡发育期补充高剂量VD(100 pg/ml)比低剂量VD(25 pg/ml)对小窦卵泡生长和卵泡形成具有更显著的促进作用。同时，Xu等[31]研究发现，卵泡周围的颗粒细胞及其各个阶段中都有VDR的表达，并随着卵泡的发育颗粒细胞中VDR的表达逐渐增多；在窦前卵泡及窦卵泡内有25-羟化酶(CYP2R1)及1α羟化酶(CYP27B1)的表达，补充VD后，窦卵泡的存活率和窦卵泡直径显著提高，表明VD通过与卵泡中VDR结合并影响卵泡的生长发育及质量，但VD对卵泡的作用可能是剂量性及阶段性的。与多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠相比，补充VD后，PCOS大鼠不同发育阶段的卵泡数量和质量均显著增高、闭锁卵泡数显著降低[32]，表明VD能够改善PCOS大鼠卵泡的生长发育。Refaat等[33]将48只雌鼠随机分为实验组和对照组，实验组给予VD补充，4周后实验组小鼠窦卵泡数、排卵期卵泡数、VDR、RXR、VDBP均显著高于对照组，表明补充VD能够促进卵泡的发育。尽管目前尚无文献直接研究VD与POI患者卵泡生长发育，但体外实验已经证明VD影响卵泡的发育，因此，我们大胆猜测VD有利于POI患者卵泡的生长发育。

三、VD与卵巢的免疫性损伤

目前，POI的具体发病机制尚不清楚，但可能与染色体异常、基因异常、免疫、感染、医源性损伤有关[1]。约20%的POI患者伴随其他自发免疫性疾病，多达40%～50%的POI患者至少有一种器官特异性自身抗体阳性，最常见的是甲状腺过氧化物酶抗体和抗甲状腺球蛋白抗体阳性[34]。卵巢通常是自身免疫攻击的目标，细胞免疫异常在自身免疫性POI的发病机制中起重要作用。目前已证实，T细胞亚群的改变、效应B细胞数量的增加、抑制/细胞毒性淋巴细胞数量的减少、自然杀伤细胞数量和活性的增加会导致自身免疫性POI[35]。VD被认为是一种免疫调节剂，能够调节B细胞和T细胞的增殖，诱导Th1型细胞向Th2型细胞的转换。免疫反应主要由Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)信号通路介导，其中Toll样受体(TLR)是单个的跨膜非催化性蛋白质，是重要的抗原识别受体。细胞表面的TLR和配体结合会导致街头蛋白(TRAF)被招募至受体的胞质域，TRAF转而招募核因子κB激酶抑制物(inhibitor of nuclear factor κB kinase，IKK)复合物，IKK复合物使IκB抑制剂磷酸化并降解，随后NF-κB进入细胞核并诱导先天免疫细胞因子IFN-γ、TNF-α的释放，从而参与机体的炎症反应、免疫应答、调节细胞凋亡和应激反应。对于复发性流产及反复种植失败患者，VD通过干扰NF-κB显著降低NK细胞中TLR4、TNF-α和IFN-γ的表达[36]，即VD通过抑制TLR4/NF-κB信号通路从而抑制免疫应答。

综上所述，VD与卵泡的招募、卵泡的生长发育以及卵巢免疫性损伤有密切的联系，因此在临床诊治过程中，应该关注POI患者的VD水平。后续仍需要深入探索VD与卵巢功能的关系，为POI患者的诊治提供新的治疗思路。