亚低温上调冷休克蛋白RBM3表达减轻肾脏缺血-再灌注损伤

宋克芹 肖琦 肖建生 罗凯锋

肾移植是终末期肾病病人的首选治疗方法[1]，肾移植的成功依赖于高质量的供肾，供肾的缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是不可避免的，有研究表明IRI是急性肾损伤、移植肾功能延迟恢复和急慢性排斥反应的危险因素[2]。

近年来，应用亚低温（30～34 ℃）来减轻IRI越来越受到关注。过去多数研究认为亚低温减轻IRI与降低能量代谢有关，近年来的研究发现，当机体温度降低时，生物体会产生一组蛋白来适应环境的变化，通常我们称此组蛋白为冷休克蛋白。RNA结合基序蛋白 3（RNA-binding motif protein 3，RBM3）是哺乳动物重要的冷休克蛋白，在32～34 ℃条件下RBM3的表达量最高[3]。RBM3属于应激反应蛋白，在其N段具有RNA结合区域，拥有一个保守的RNA识别基序，包含两个核糖核蛋白结构域[4]，在应激反应中，RBM3可以结合并改变信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的翻译。研究发现，RBM3可与Yes相关蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）mRNA的3’非翻译区结合，改变其稳定性及翻译效率[5]。YAP1是Hippo通路中最重要的效应因子之一，是调节细胞增殖、凋亡和器官再生的重要蛋白[6]。YAP1亦可上调核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的表达[7-8]，转录因子Nrf2是抗氧化和细胞保护系统的主调节因子。亚低温减轻肾脏IRI与RBM3及其下游效应分子YAP1的关系尚未见报道，本实验通过建立大鼠双侧肾脏IRI模型并用亚低温进行预处理后，探讨亚低温对肾脏IRI的作用和RBM3及其下游效应分子YAP1/Nrf2在这一过程的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

200～250 g的无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性SD大鼠18只，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，饲养于武汉大学中南医院动物实验中心，随机分为正常对照（normal control，NC）组、IRI组和亚低温预处理（mild hypothermia preconditioning，MHP）组，每组6只。本研究经武汉大学动物实验伦理委员会审批通过。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液套装、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）检测试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司，β-肌动蛋白（β-actin）、YAP1、B淋巴细胞瘤（B-cell lymphoma，Bcl）-2、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）一抗和相应二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司，RBM3一抗购自英国Abcam公司，Nrf2一抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

主要仪器：智能恒温控制仪购自天津建科试验仪器厂，光学显微镜（光镜）及荧光显微镜购自日本Olympus公司，低温高速离心机购自上海力康生物医疗科技控股有限公司，化学发光凝胶成像系统购自上海培清科技有限公司。

1.3 模型建立和标本获取

IRI组大鼠用1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧于有加热垫的操作台上，使体温维持在（37±0.5）℃，沿腹中线剃毛并消毒，暴露腹腔后游离双侧肾蒂，用2-0缝线结扎阻断肾动、静脉血流45 min后打开，关闭腹腔。MHP组大鼠麻醉和消毒同IRI组，用75%乙醇擦拭腹部快速降温至32℃左右，使其体温维持在（32±0.5）℃[9]，2 h后缓慢升温至37℃左右，按前述方法建立肾脏IRI模型。NC组大鼠除了不阻断肾动、静脉血流外，其余处理同IRI组。

术后自由进食饮水，24 h后再次麻醉，收集血液标本和肾脏组织，部分组织放液氮中保存、部分组织放4%多聚甲醛中固定后行HE染色。每组分别取6只大鼠的标本用于后续实验。

1.4 实验方法

1.4.1 血清肌酐水平检测 采用全自动生化仪检测血清肌酐水平。

1.4.2 肾脏组织HE染色和病理损伤评分 肾脏组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。石蜡切片切成5 mm，按标准过程进行HE染色[10]。光镜下观察和拍照。由两位病理科医师采用双盲法对组织损伤程度进行评分。评分标准如下：随机选取10个无重叠的视野（×200），评分反映小管坏死、刷状缘脱落、管型形成和小管扩张的分级，分别为0分（无）、1分（≤10%）、2分（11%～25%）、3分（26%～45%）、4分（46%～75%）和5分（≥76%）[11]。

1.4.3 蛋白质印迹法检测组织蛋白 提取各组大鼠肾脏组织总蛋白后加入10%的分离胶中，电泳、转膜后封闭，置于1:1 000 的一抗（RBM3、YAP1、Nrf2、Bcl-2、Bax）溶液中4 ℃孵育过夜，洗涤后加入1:5 000的二抗溶液室温孵育2 h，用超敏化学发光剂液在暗室中显影，用β-actin作为内参。采用Image J软件定量分析各组RBM3、YAP1、Nrf2蛋白相对表达量和Bcl-2/Bax比值。

1.4.4 免疫组织化学法检测组织蛋白 将石蜡切片进行脱蜡水化和抗原修复，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤，过氧化氢孵育后封闭，滴加一抗RBM3（1:500）、YAP1（1:1 000）溶液4 ℃过夜，PBS洗涤，滴加1:1 000的二抗溶液室温孵育50 min，PBS洗涤后滴加显色液，苏木素复染后封片，光镜下观察和拍照，观察各组RBM3、YAP1阳性细胞分布情况。

1.4.5 TUNEL法检测细胞凋亡 石蜡切片经脱蜡水化，在切片上滴加TUNEL反应液37℃孵育2 h，PBS洗涤后滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min，PBS洗涤后封片，使用荧光显微镜观察并采集图像，比较各组肾脏组织细胞凋亡率。

1.4.6 氧化应激相关指标检测 按照MDA和SOD检测试剂盒说明书，逐步加入样本及试剂于96孔板中，用酶标仪测定吸光度值，分别计算各组MDA含量和SOD活性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肾功能和肾脏组织病理学表现

NC组、IRI组、MHP组血清肌酐分别为（29.7±2.8）、（407.1±13.5）、（317.3±14.4）μmol/L，IRI组和MHP组血清肌酐水平均高于NC组，而MHP组血清肌酐水平低于IRI组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。肾脏组织HE染色结果显示，NC组肾脏结构基本正常，IRI组与MHP组均可见肾小管坏死，胞核固缩深染、碎裂或溶解，胞质嗜酸性增强，皮髓质交界处淤血，髓质集合管扩张，上皮扁平化，可见蛋白管型形成，MHP组肾脏组织小管坏死、淤血面积小于IRI组，且小管扩张程度更轻、蛋白管型形成更少（图1A）；NC组、IRI组、MHP组肾脏组织病理损伤评分分别为（0.78±0.12）、（4.57±0.29）、（3.03±0.60）分，IRI组和MHP组病理损伤评分均高于NC组，而MHP组评分低于IRI组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05，图1B），提示亚低温预处理对肾脏IRI具有保护作用。

2.2 各组大鼠肾脏组织蛋白表达水平

蛋白质印迹法检测结果显示，与NC组比较，IRI组和MHP组RBM3、YAP1和Nrf2蛋白相对表达量均升高（均为P＜0.05），并且MHP组较IRI组更高（均为P＜0.05）；与NC组比较，IRI组和MHP组Bcl-2/Bax比值均降低（均为P＜0.05），MHP组Bcl-2/Bax比值较IRI组升高（P＜0.05），提示亚低温预处理可上调RBM3、YAP1、Nrf2蛋白表达和Bcl-2/Bax比值（图2）。免疫组织化学染色结果显示，NC组RBM3和YAP1阳性细胞数最少，MHP组阳性细胞数最多，IRI组阳性细胞数量位于二者之间，提示亚低温预处理可上调RBM3与YAP1蛋白的表达（图3）。

图2 各组大鼠肾脏组织蛋白表达水平比较Figure 2 Comparison of protein expression levels in kidney tissues of rats among each group

图3 各组大鼠肾脏组织RBM3和YAP1阳性细胞分布情况（免疫组织化学，×200）Figure 3 Distribution of RBM3 and YAP1 positive cells in kidney tissues of rats among each group

2.3 各组大鼠肾脏组织细胞凋亡情况

TUNEL染色结果显示，NC组、IRI组、MHP组肾脏组织细胞凋亡率分别为（0.76±0.15）%、（10.42±0.42）%、（3.79±0.33）%，IRI组和MHP组细胞凋亡率均高于NC组（均为P＜0.05），MHP组细胞凋亡率低于IRI组（P＜0.05），提示亚低温预处理可减轻肾脏IRI引起的细胞凋亡（图4）。

图4 各组大鼠肾脏组织细胞凋亡率比较Figure 4 Comparison of the apoptosis rate in kidney tissues of rats among each group

2.4 各组大鼠肾脏组织氧化应激水平

MDA含量检测结果显示，NC组、IRI组、MHP组MDA含量分别为（0.52±0.07）、（1.38±0.03）、（0.80±0.06）nmol/mg，IRI组 和 MHP组 MDA 含量均高于NC组，MHP组MDA含量低于IRI组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。SOD活性检测结果显示，NC组、IRI组、MHP组SOD活性分别为（1 060±63）、（499±28）、（833±54）U/mg，IRI组和MHP组SOD活性均低于NC组，MHP组SOD活性高于IRI组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。提示亚低温预处理可减轻肾脏IRI所致氧化应激损伤并增强抗氧化能力（图5）。

图5 各组大鼠肾脏组织氧化应激水平比较Figure 5 Comparison of oxidative stress levels in kidney tissues of rats among each group

3 讨 论

IRI是肾移植过程不可避免的损伤，这是影响移植物长期存活的重要因素。IRI主要是血流再灌注后组织内黄嘌呤氧化酶生成的氧自由基引起的，另外再灌注时，细胞外Ca2+进入细胞内，进一步加重钙超载，Ca2+浓度增加还可以使磷脂酶、蛋白酶激活，导致细胞不可逆性损伤[12]。国内外学者一直在寻找能够减轻IRI的方法，这些措施包括缺血预处理、缺血后处理、药物处理、基因调控以及机械灌注等[13-18]。

近年来，应用亚低温来减轻器官组织IRI越来越受到学者们的关注。亚低温治疗是指将病人的体温降至30～34 ℃而达到预防或治疗疾病目的的方法，应用亚低温预防组织IRI已有很多的研究报道[19]。亚低温治疗在实验性脑卒中模型和卒中病人中被公认为有效的神经保护方法，并扩展了其他神经保护剂的治疗窗口[20]。在肝脏IRI动物模型中，亚低温预处理可以减轻肝脏IRI所致线粒体损伤和氧化应激损伤[21-22]。在本实验中，MHP组的血清肌酐水平及肾脏组织病理损伤评分均低于IRI组，证实了亚低温预处理对肾脏组织IRI具有保护作用。亚低温对IRI保护作用的机制可能不仅仅与降低能量代谢有关，当生物体温度下降时会产生RBM3蛋白，当体温为32℃时可诱导其高表达[3]。RBM3不仅在低温环境下表达量上升，在一些癌症组织以及低氧环境中表达也会上调[23-24]。在本实验中，MHP组RBM3蛋白表达量高于IRI组，提示肾脏组织在缺氧和亚低温环境的双重刺激下诱导了RBM3蛋白高表达。

研究发现RBM3可以与YAP1的mRNA 3’-非翻译区相结合，控制其转录和翻译，YAP1是RBM3蛋白的靶蛋白之一[5]。YAP1蛋白是Hippo通路中最重要的效应因子之一，是调节细胞增殖、凋亡和器官再生的重要蛋白[6]。以往研究显示，YAP1在前列腺癌、胰腺癌、胆囊癌以及胃癌等多种肿瘤中表达异常升高，具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的功能[25-28]。在本实验中，YAP1蛋白的表达趋势与RBM3一致，二者在MHP组表达量最高；同时，MHP组细胞凋亡率明显低于IRI组，提示亚低温预处理可减少细胞凋亡，Bcl-2/Bax比值升高，表明细胞抗凋亡能力增强，其作用机制可能为亚低温通过上调RBM3和YAP1蛋白抑制细胞凋亡。

氧化应激损伤是IRI的另一重要病理生理过程，氧化应激损伤是由血流再灌注后组织内黄嘌呤氧化酶生成的氧自由基引起的，当体内氧自由基的生成量超过体内抗氧化防御机制则会产生氧化应激损伤。MDA是IRI诱导的线粒体损伤的标志[29]，SOD是抗氧化防御机制的重要组成部分，有利于过氧化物的去除和还原[30]。在本实验中，通过检测MDA含量和SOD活性来评估氧化应激损伤，结果显示MHP组的MDA含量较IRI组明显下降，SOD活性较IRI组明显升高，提示亚低温处理可降低MDA含量和提升SOD活性，表明亚低温治疗可以减轻大鼠肾脏IRI的氧化损伤并改善抗氧化防御系统。但亚低温减轻氧化应激损伤的作用机制尚不明确，是否与亚低温诱导的YAP1蛋白相关？在卵巢癌和膀胱癌化学药物治疗耐药的研究中发现，YAP1的表达上调伴随着Nrf2的表达增加，而沉默YAP1的表达伴随着Nrf2的表达下调，并且YAP1表达下调后细胞的抗氧化活性降低[6-7]。转录因子Nrf2是抗氧化和细胞保护系统的主调节因子。在生理条件下，Nrf2会降解，细胞氧化应激触发Keap1 Nrf2复合体的构象变化，从而阻止Nrf2的降解，未降解的Nrf2与小Maf蛋白形成异二聚体，并通过抗氧化反应元件/亲电反应元件激活靶基因以保护细胞[31-32]。在本实验中，Nrf2的表达与YAP1的表达趋势一致，结合YAP1的表达趋势又与RBM3相一致，说明亚低温减轻氧化应激损伤的作用机制可能是通过RBM3/YAP1/Nrf2通路来实现的。

综上所述，亚低温预处理对肾脏IRI具有保护作用，可减轻IRI所致细胞凋亡和氧化应激损伤，其机制可能通过诱导RBM3及其下游分子YAP1/Nrf2蛋白表达上调来实现，但具体作用机制还需进一步论证。本研究为亚低温预处理减轻IRI提供了新的见解，为减轻供肾IRI提供了潜在的新的分子靶点。