骨髓间充质干细胞对小鼠缺血-再灌注急性肾损伤中IL-10和TNF-α表达的影响

蔺晨雨 陈文 马锡慧 孔祥瑞 樊文梅 韩永 肖漓 石炳毅

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是常见的由多种病因引起的肾功能急性下降综合征[1-2]。文献报道，外科手术引起的AKI是院内病死率高的主要原因之一[3-5]，特别在肾移植术后，缺血-再灌注AKI（ischemia-reperfusion AKI，IR-AKI）如果得不到及时干预，会引起移植物功能延迟恢复或失功[6-7]。研究发现，缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是一种系统性炎症性疾病，炎症过程中细胞因子是促炎反应和抑炎反应动态平衡的物质基础，肾IRI的修复与促炎因子和抑炎因子的生成、释放相关，炎症消退后肾组织得以修复[8]。其中白细胞介素（interleukin，IL）-10是一种具有多效性的细胞因子，由调节性T细胞、肾小管上皮细胞、B细胞、单核-巨噬细胞、角化细胞、肿瘤细胞和辅助性T细胞（helper T cell，Th）1等多种细胞分泌[9]。IL-10可减轻不同病理生理条件下的组织损伤，但内源性IL-10在肾IRI修复中的作用报道少见[10]。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α属于TNF超家族，是由单核细胞衍生的细胞因子，生物学活性复杂，参与对造血、免疫和炎症的调节，与肾脏缺血性疾病密切相关[11-12]。

近年来，在器官移植和IRI领域，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）作为潜在的治疗因子取得了积极的进展。BMSC具有免疫调节、抗炎和组织修复等生物学作用，能够靶向迁移至损伤部位，并通过旁分泌机制促进损伤修复[13-15]。早期研究发现在肾IRI时，BMSC能够减轻缺血性损伤，加速损伤部位再生[16]。但BMSC的应用仍然存在诸多问题需要阐明。本研究拟观察在小鼠肾IRI过程中，输注BMSC对IL-10与TNF-α的影响，以进一步补充研究IR-AKI的病理机制，并探讨BMSC的修复作用和可能机制，为AKI的治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

6～8周龄雄性C57BL/6小鼠购于北京斯贝福生物技术有限公司，清洁等级为无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级。小鼠随机分为假手术组（对照组）、IRI组和BMSC治疗组（BMSC组），每组6只。对照组小鼠用2%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉，于37 ℃恒温板上固定，取腹部正中切口，逐层分离皮肤、皮下组织、腹膜，然后用生理盐水浸湿的纱布覆盖腹部30 min后缝合腹部；IRI组步骤同对照组，打开腹腔后，进入腹腔，先找到左侧肾蒂，用无创性动脉夹迅速夹闭肾蒂计时，然后找到右侧肾蒂夹闭计时，分别到30 min后去掉各自动脉夹，让血流恢复灌注后缝合腹部；BMSC组用IRI组的方法建立IR-AKI模型后，经尾静脉输注BMSC 0.1 mL（1×107/mL）。本实验经中国人民解放军总医院第八医学中心实验动物管理伦理委员会批准。

1.2 BMSC来源和分组

C57BL/6小鼠BMSC及其完全培养基购于广州赛业生物科技有限公司。传代后的BMSC融合至50%左右时血清饥饿24 h，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗2次，在37 ℃矿物油中浸泡60 min，用大量PBS冲洗多次后，恢复完全培养基培养24 h（IRI组）。将正常培养的BMSC作为对照组。提取细胞上清备用。

1.3 实验试剂

PBS购于美国Hyclone公司；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nickend labeling，TUNEL）试剂盒、矿物油购于美国Sigma-Aldrich公司；含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的封片剂购于北京中杉金桥生物科技有限公司；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）试剂盒购于深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠BMSC的培养和输注 小鼠BMSC用完全培养基复苏于培养瓶中，在37 ℃、5% CO2、95%湿度条件下常规培养。复苏24 h后换液，此后每隔2～3 d更换培养液。细胞长到80%～90%融合时传代，提取第3代细胞用PBS重悬，制成活细胞悬液（浓度为1×107/mL），经尾静脉注射入实验小鼠体内。

1.4.2 样本采集 小鼠IRI模型成功建立后，每隔24 h观察各组小鼠状态，并于72 h后摘眼球取血并编号，然后处死取双侧肾组织根据分组编号并固定于10%多聚甲醛溶液中。

1.4.3 小鼠肾功能检测 小鼠血于室温静置30 min观察到有明显分层后，1 125×g离心5 min后吸取上层血清，全自动生化分析仪测定血清肌酐（serum creatinine，Scr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。

1.4.4 肾组织病理学检查 石蜡包被固定肾组织，4 μm连续切片，常规行苏木素-伊红（hematoxylineosin，HE）染色，光学显微镜下观察并拍照。染色的组织切片使用半定量标尺进行评分，采用双盲法评估肾小管坏死的程度。肾组织损伤定义为肾小管坏死、肾小管扩张和（或）萎缩、炎症细胞浸润或细胞水肿，评分为0～4分。分数越高表示损伤越严重：0分为正常肾，1分为轻度坏死（皮质或髓质受累＜5%），2分为轻中度坏死（皮质或髓质受累5%～25%），3分为中度坏死（皮质或髓质受累26%～75%），4分为重度坏死（皮质或髓质受累＞75%）。

1.4.5 TUNEL染色检测肾组织细胞凋亡 按照试剂盒中说明书配置好TUNEL反应混合物，置于冰盒上备用。石蜡切片常规脱蜡、复水后，将载玻片放入装有柠檬酸盐缓冲液中，微波辐射5 min，PBS冲洗2次，样品周围干燥后加50 μ L TUNEL反应混合物，加盖子在恒温培养箱37 ℃潮湿黑暗环境中孵育60 min。PBS冲洗3次，用含DAPI的封片剂封片，荧光显微镜下观察并拍照。每组切片随机选取1张，每张随机选取10个视野，计数凋亡细胞个数。

1.4.6 ELISA检测IL-10与TNF-α水平 ELISA检测各组小鼠血清与两组BMSC细胞上清中的IL-10与TNF-α水平，实验步骤按照试剂盒内说明书进行。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用ANOVA单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用两独立样本t检验。方差不齐的计量资料、等级资料的比较采用Kruskal-WallisH检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSC输注对IRI小鼠肾组织形态和肾功能的影响

IRI 72 h后，对照组小鼠肾组织结构正常；IRI组肾组织结构损伤严重，表现为广泛的急性肾小管坏死，大量炎症细胞浸润，肾小管扩张，皮质和外髓刷状缘消失；BMSC组损伤较轻，炎症细胞浸润较少，细胞水肿较轻，边缘较清晰（图1A）。与对照组比较，IRI组和BMSC组肾组织损伤评分较高；与IRI组比较，BMSC组肾组织损伤评分较低（均为P＜0.05，图1B）。

IRI 72 h后，3组小鼠Scr和BUN水平比较见图1C、D。与对照组比较，IRI组Scr水平升高；与IRI组比较，BMSC组Scr水平下降，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）；BMSC组与对照组比较，差异无统计学意义（P=0.272）。与对照组比较，IRI组和BMSC组BUN水平升高；与IRI组比较，BMSC组BUN水平下降（均为P＜0.05）。

图1 各组小鼠肾组织病理学和肾功能变化Figure 1 Changes in renal histopathology and renal function of mice in each group

2.2 BMSC输注对IRI小鼠肾组织细胞凋亡的影响

各组小鼠肾组织细胞凋亡情况见图2。与对照组比较，IRI组和BMSC组凋亡细胞数量增多[（2.0±1.4）个比（18.4±3.7）、（9.4±3.1）个，均为P＜0.05]；与IRI组比较，BMSC组凋亡细胞数量减少[（18.4±3.7）个比（9.4±3.1）个，P＜0.05]。

图2 各组小鼠肾组织细胞凋亡情况（TUNEL，×400）Figure 2 Cell apoptosis of renal tissues of mice in each group

2.3 BMSC输注对IRI小鼠外周血中IL-10和TNF-α的影响

IRI 72 h后，各组小鼠外周血中IL-10和TNF-α的表达情况见图3。与对照组比较，IRI组和BMSC组小鼠血清IL-10水平升高；与IRI组比较，BMSC组小鼠血清IL-10水平下降（均为P＜0.05）。与对照组比较，IRI组小鼠血清TNF-α水平升高，BMSC组小鼠血清TNF-α水平下降；与IRI组比较，BMSC组小鼠血清TNF-α水平下降（均为P＜0.05）。

图3 各组小鼠外周血IL-10和TNF-α的表达情况Figure 3 The expression of IL-10 and TNF-α in peripheral blood of mice in each group

2.4 缺氧复氧对BMSC分泌IL-10和TNF-α的影响

对照组和IRI组BMSC上清中IL-10水平分别为（51.3±2.0）pg/mL和（55.2±2.6）pg/mL，TNF-α水平分别为（52.5±2.2）pg/mL和（58.8±17.0）pg/mL，两组比较差异均无统计学意义（t=-1.944，P=0.080；t=-0.501，P=0.627）。

3 讨 论

肾IRI与TNF-α释放、IL-6诱导以及中性粒细胞介导的细胞毒性损伤等炎症反应密切相关[17]。TNF-α在正常肾脏中表达水平较低，在IRI后数分钟到数小时内上调，诱导多种炎症基因表达，促进炎症反应，加重组织损伤[10]。Hou等[12]发现使用小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）下调TNF-α的表达，可显著减轻IRI所致的肾功能障碍。研究发现，细胞因子是肾损伤修复的重要炎症介质，其中抑炎因子IL-10可反向调节炎症急性期反应的多种炎症因子[18-19]。Sakai等[20]对比了IL-10-/-小鼠与野生型小鼠在IRI后不同时间TNF-α表达水平的变化，发现野生型小鼠TNF-α的表达在IRI后5 h开始升高，24 h到达峰值，而IL-10-/-小鼠IRI后5 h即可到达峰值。表明IL-10可通过抑制炎症介质减轻炎症细胞浸润，改善肾IRI。

本研究结果显示，BMSC组小鼠肾功能改善，外周血中TNF-α表达减少，提示BMSC修复小鼠IRAKI是通过降低TNF-α的表达水平对肾组织起保护作用，而IL-10的表达水平未升高，提示IL-10不直接参与BMSC的保护作用，其机制有待进一步验证和讨论。此外，我们还观察到在体外模拟的IRI条件下，BMSC几乎不分泌TNF-α和IL-10。

与我们的研究结果一致，已有研究报道BMSC可通过抑制体内TNF-α的释放改善IR-AKI[21-22]。BMSC具有向中胚层组织分化的能力，改善IRI后肾脏的结构和功能，其机制包括减轻炎症、减少凋亡、促进自噬、改善组织纤维化以及加速肾间质细胞增殖等[23-25]。

与其他报道有所不同，本研究中输注BMSC后IL-10的表达水平降低。其他研究发现IRI后TNF-α和IL-10可同步升高，TNF-α的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表达显著增加，刺激单核细胞合成IL-10，从而抑制炎症反应以修复IRI[26]。而IL-10又可调节单核-巨噬细胞的表型和功能活性，从而下调单核细胞衍生细胞因子的产生，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-8等[10,27]。TNF-α与IL-10相互调节，是由于机体启动体内调节性免疫细胞网络发挥作用以维持IRI后的免疫稳态[28-29]，而BMSC输注可影响负性调节功能的免疫细胞及其衍生的细胞因子[30]。

IRI时，调节性免疫细胞与衍生细胞因子系统的交互作用，以及细胞因子产生并彼此影响的时间依赖性，可能是输注BMSC修复IR-AKI后IL-10的表达水平降低的原因之一。此外，有研究证明IR-AKI与线粒体自噬受体B淋巴细胞瘤-2和腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3（B cell lymphoma-2 and adenovirus E1B 19 kD-interacting protein 3，BNIP3）介导的线粒体自噬有关[30-31]。PTEN诱导假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）-帕金森病蛋白介导的线粒体自噬可促进IR-AKI的损伤修复[32-33]。研究发现，IL-10可以通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号促进线粒体自噬，保护线粒体结构完整，减轻组织损伤[34]。

BMSC可修复IRI并保护线粒体完整性，减少活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），但具体机制尚不完全清楚[23]。BMSC输注后，可能直接促进线粒体自噬，修复损伤组织，而IL-10的负性调节或不直接参与对线粒体自噬的促进作用，可以解释输注BMSC修复IR-AKI后IL-10的表达水平降低。目前有较多的相关研究报道，由于疾病种类、发生部位、动物模型、干细胞种属或来源以及细胞因子种类，特别是时相性、采用的技术方法的差异性，出现了趋势一致、结果不统一或结论相悖。本研究结果提示BMSC可能通过促进线粒体自噬等途径直接修复损伤肾组织，而非上调IL-10减轻肾IRI，其机制亟待后续进一步的研究证实。

本研究的初步探讨，为临床提供了新的实验依据，但存在样本量有限且尚在动物模型实验阶段，仍然需要更进一步的验证。今后，进一步精细化观察炎症因子的时间、浓度依赖性，有助于临床对BMSC输注时间和浓度的选择，根据特定时间炎症因子的水平进行早期干预，可能成为治疗IR-AKI的有效手段。此外本研究提示了BMSC在IR-AKI修复中可能存在抗炎反应之外的修复机制，需深入阐释其中的机制后为临床应用提供崭新的视角。