高通量测序分析南美洲圭亚那输变电周围金属锈蚀材料中细菌多样性的研究

李 苗

（中国机械进出口（集团）有限公司，北京 100037）

0 引言

2009年10月28日，中机公司与圭亚那电力照明公司成功签订了圭亚那输变电项目的EPC总承包合同，该项目内容主要包括：架设110公里输电线路、新建7个变电站、扩建和改造原有3个变电站、铺设2.1公里海缆、架设95公里69千伏高压输电线路和154公里的ADSS通讯光缆，项目总工期为912天。

南美洲圭亚那国地处热湿的赤道地区，常年湿度高、温度变化小，平均气温在24～32°C之间，全年有两个雨季，常年湿热多雨，年均降水量超过1600～3000mm，相对湿度为70%～100%，高温多湿的环境条件有利于输变电金属设备材料表面的微生物生长，容易促进金属锈蚀。此外，由于变电站和输电线路的所使用的设备和材料，常常会安装在户外，会经受长年累月的自然环境侵蚀，包括风吹、日晒和雨淋，这些都促进了设备和材料的表面微生物的生长，进而导致金属锈蚀。

通常情况下，微生物腐蚀（Microbiologically Influenced Corrosion，MIC）导致的金属腐蚀，是因腐蚀微生物在金属表面繁衍和新陈代谢，进而改变了金属理化性质和稳定性，从而引起金属电化学腐蚀[1]。微生物腐蚀对工农业众多部门造成了巨大影响和经济损失，全球因微生物腐蚀造成的经济损失约占总腐蚀的20%[2]。因此，微生物腐蚀的有效防治迫在眉睫，而对金属锈蚀相关微生物的研究也具有非常重要的意义。

与金属锈蚀相关的微生物在生理上是多样的，其中细菌广泛参与钢、铁、铜、铝及其合金腐蚀过程，如硫酸盐还原菌、硫氧化菌、铁氧化及还原菌、锰氧化菌和有机酸分泌菌[2,3]。目前，虽然国内外对金属锈蚀材料中细菌物种多样性及其作用已有相关报道，但研究多基于传统的分离培养，并根据其形态、生理、生化等实验来确定细菌种类，例如，对锈蚀样品中可培养细菌进行分离培养以鉴定其种类[4]，其局限性在于培养条件的限制导致许多细菌种类无法培养，也有采用克隆文库的方法进行金属腐蚀材料中细菌多样性研究[5,6]，但仅仅分析序列的通量低，从而无法完全反映样本中的细菌群落情况。

目前，基于DNA测序的高通量技术广泛地运用到环境样本中微生物多样性及其群落结构研究[7,8]，其可以深度揭示环境中丰富的微生物多样性，包括大量可培养及未培养的微生物类群。目前为止，利用高通量测序来分析金属锈蚀材料中细菌物种多样性及其群落组成的研究报道较少。

圭亚那输变电项目已经顺利建成和移交，而设备在服役过程中的锈蚀与防护问题是今后关注的重点。本研究采用高通量测序技术对圭亚那输变电周围区域金属锈蚀样品中细菌物种多样性及其群落组成进行研究，揭示了该区域具腐蚀作用的微生物种类，这将为设备供货商的研发人员提供在设备防锈蚀策略方面的理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究地点和样品采集

采样地点位于南美洲圭亚那输变电项目工程沿线周围区域（如图1所示），6份金属锈蚀样品均使用表面消毒（75%乙醇）的采样铲采集，将采集的金属锈蚀样品直接放入TWIRL’EM无菌采样袋（Labplas Inc., Sainte-Julie, QC, Canada）。采样时间为2015年4月，总共采集6个金属锈蚀样品（如表1所示）。在圭亚那期间，采集后的锈蚀样品置于-20°C冰箱中，直至空运带回国。

表1 圭亚那输变电周围区域金属锈蚀样品的数据信息

图1 圭亚那输变电周围区域金属锈蚀样品采集地点

1.2 微生物DNA提取、PCR扩增及测序

每个锈蚀样品约0.25g通过PowerSoil DNA提取试剂盒（MO BIO Laboratories，San Diego，CA，USA）进行微生物总DNA的提取。对DNA样品中16S rRNA 基因的V3～V4区进行扩增，引物为338F（5'-条码-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R （5'-条码-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3'）[9]。PCR反应体系（50μL）：5×PCR buffer（with Mg2+）4μL；2.5mmol/L dNTP 2μL；5μmol/L P1 （338F）0.8μL；5μmol/L P2（806R）0.8μL；5U/μL Taq 酶0.4μL；DNA模板2μL；ddH2O10μL。PCR反应条件：95°C 3min；95°C 30s，55°C 30s，72°C 45s，30个循环；72°C 1min。PCR 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后回收产物条带，Qubit 测定浓度并连接接头完成文库构建。其中，PCR实验及其定量、纯化、文库构建与高通量测序，均由华大基因有限公司完成，测序使用Illumina Miseq PE300测序平台，产生300 bp配对双端序列。原始序列数据存入NCBI Sequence Read Archive数据库（登录号：PRJNA347281）。

1.3 序列处理及数据分析

配对末端读取原始的DNA片段使用Flash软件[10]合并配对序列，配对序列根据分配给每个样本的独特条码来识别，合并时配对序列需要具有部分重叠区域。原始测序数据质量使用QIIME 1.8.0软件处理[11]（Caporaso et al.，2010），不能组装的序列被丢弃。操作分类单元（OTU）使用UPARSE软件按照97%序列相似性进行聚类[12]；使用UCHIME进行嵌合序列的识别和删除[13]。单克隆序列被删除。16S rRNA基因序列的分类是通过RDP[14]对Silva rRNA基因数据库（ http://www.arb-silva.de/）进行比对确定（80%的置信度阈值）。利用MicrobiomeAnalyst（Marker Data profiling，MDP，https://www.microbioeanalyst.ca/）在线分析平台[15]分析细菌群落的物种丰富度（Chao1指数）、多样性（香浓指数，H）、在门、纲、目、属水平上的群落组成、聚类及热力图分析。

2 结果

2.1 细菌群落物种丰富度及多样性

对6份锈蚀样品进行高通量测序分析，总共发现139626个序列，可划分为522个可操作分类单元。每个锈蚀样品中OTU数量在91～303之间（如表1所示）。测序覆盖率为99.83%～99.91%（如图2所示），表明数据有效可靠。利用Chao1指数和香浓指数比较不同样品中细菌群落的丰富度和多样性（如图3所示），结果显示6份不同锈蚀样品中细菌群落在物种丰富度及多样性指数方面存在一定差异，其中样品G2细菌群落的物种丰富度及多样性指数最低，而样品G6细菌群落的物种丰富度及多样性最高。

图2 6份金属锈蚀样品中细菌群落的稀释度曲线

图3 6份金属锈蚀样品中细菌群落丰富度及多样性

2.2 细菌群落组成

将高通量测序结果进行分析，6份锈蚀样品中总共获得分类学地位明确的细菌有13门、24纲、64目、166属，此外，还存在部分未指定分类的细菌种类。总体而言，优势门为放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、奇异球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chlor of lexi）。同时不同锈蚀样品在优势门也存在一定差异，例如放线菌门（Actinobacteria）在样品G2和G4中最为优势，而变形菌门（Proteobacteria） 在样品G1和G6中最为优势，拟杆菌门（Bacteroidetes）在样品G3中最为优势，绿弯菌门（Chloroflexi）在样品G5中最为丰富。

6份锈蚀样品总体统计，优势纲包括放线菌纲（Actinobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、噬纤维菌纲（Cytophagia）、酸杆菌纲（Acidobacteria）、β-变形菌纲（ Betaproteobacteria）、异常球菌纲（Deinococci）；优势目包括噬纤维菌目（Cytophagales）、红色杆菌目（Rubrobacterales）、红螺菌目（Rhodospirillales）、异常球菌目（Deinococcales）等；优势属包括 囊胚菌属（Blastocatella）、红色杆菌属（Rubrobacter）、螺状菌属（ Spirosoma）、甲基杆菌属（Methylobacterium） 、放线孢菌属（Actinomycetospora）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）等（如图4所示）。

图4 6份金属锈蚀样品中细菌门、纲、目、属水平的组成柱状图

此外，根据不同细菌目在6份锈蚀样品中的丰度进行聚类分析，从而反映6份锈蚀样品间在细菌群落相似性、差异性及聚类关系。热图（如图5所示）结果显示，不同的锈蚀样品在目水平上存在差异，其中样品G1，G5和G6聚在一起，样品G2、G3和G4聚在一起。

图5 6份金属锈蚀样品间微生物群落结构在目水平的热图分析

3 讨论

微生物腐蚀依赖于组成生物膜的微生物种类及其生物膜生长的因素[16]。目前为止，人们还未能完全了解微生物参与金属腐蚀过程的机理，其重要原因在于，人们对组成生物膜的微生物仍然知之甚少，本研究采用Illumina高通量测序方法对圭亚那输变电周围区域金属锈层中细菌群落进行分析，有利于了解该区域金属锈蚀过程中细菌群落组成情况。

本研究发现，圭亚那6份金属锈蚀样品中，优势门为放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、奇异球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi），其中变形菌门中优势菌纲α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）。上述研究与前期他人研究有所不同，例如，栾鑫等[5]通过分子克隆测序，研究海水环境中Q235碳钢锈层中微生物群落的多样性，发现13个已知的菌门，包括变形菌门；拟杆菌门；硅藻门；酸杆菌门；浮霉菌门；硝化螺旋菌门；厚壁菌门；绿弯菌门；疣微菌门；绿菌门；放线菌门；红藻门以及螺旋体门。内外锈层的优势菌均为变形菌门。

根据种类及功能的不同，腐蚀微生物可以分为硫酸盐还原菌、硫氧化菌、产酸菌、铁氧化细菌、铁还原细菌、硝酸盐还原菌以及产粘液细菌等[2,3]。但本研究中，高通量测序并未发现常见的硫酸盐还原菌（例如，Desulfovibrio）、硫氧化菌（例如，Thiobacillus）、产酸菌（例如，Acetobacter）、铁氧化细菌（例如，Aciditiobacillus）、铁还原细菌（例如，Geobacter）、硝酸盐还原菌（例如，Klebsiellamobilis），仅仅发现具有产粘液细菌，例如芽孢杆菌属（Bacillus）及假单孢菌属（Pseudononas），它们在金属表面能产生大量胞外多聚物，这在微生物腐蚀中起着重要作用，是形成的生物膜的基质结构，能使周围环境在有氧与无氧之间转化，形成适宜其他腐蚀相关微生物生长的微环境[17]。本研究揭示了圭亚那输变电周围区域金属锈层中细菌群落多样性，结果表明其细菌群落丰富多样，但由于许多细菌种属金属锈蚀作用尚未明确，所以在本研究中高通量测序发现的细菌种属还需后续深入功能研究。

目前，对于微生物腐蚀的防治只能延缓腐蚀，其中，实时监测是防治金属微生物腐蚀的重要措施，对腐蚀过程中微生物群落多样性、群落组成及生物膜的厚度等进行监测，有助于我们采取控制措施，高通量测序技术的优势可以用于早期监控，通过早期监测来采取控制措施从而减缓锈蚀，避免事故发生。

如果能阻止微生物接触到金属，或者微生物在金属表层是处于非活性状态，或者使金属表面维持电化学稳定，那么腐蚀相关微生物的活动是不会影响金属锈蚀。基于上述原理，微生物防腐措施可分为物理方法（紫外线、超声波、电离辐射、机械清除法）、化学方法（亚硝酸盐和硝酸盐等杀菌剂或抑菌剂）、电化学保护（阴极保护电位）、表面改性法（表面添加防护涂层，包括镀铬、镀锌、油漆、塑料、有机涂层等）[18-20]。考虑到圭亚那输变电工程后续维修成本，建议对输变电设备进行防护涂层处理，同时利用高通量测序技术对金属表层微生物群落进行长期监测，对发现的早期金属锈蚀进行有效防护处理，如采用物理或化学方法进行除菌或抑菌处理。比如，对刚刚出现起泡现象的设备金属外壳进行去锈、打磨、刷涂冷镀锌油漆等。另外，建议相关研发部门在设备表面的涂层中添加某些可以抑制或者杀灭该地区相关微生物的某些药品，以便在更大程度上减少金属锈蚀现象。