荧光碳点的水热法制备及其在检测方面的应用

刘 博，杨 焜，魏晓慧，蔡军杰，李 钒，田 丰

（军事科学院系统工程研究院卫勤保障技术研究所，天津 300161）

0 引言

碳点（carbon dots，CDs）是碳材料中一种新型的纳米功能材料。2004年，Xu等[1]采用凝胶电泳分离纯化电弧放电法制备单壁碳纳米管，首次发现了一种具有荧光性能的碳纳米颗粒。2006年，Sun等[2]利用激光蚀刻技术刻蚀碳靶制得荧光碳纳米颗粒，并首次命名为碳点。碳点具有优良的光学性能[3]、稳定的荧光性质[4]、良好的生物相容性[5]等特点[6-7]。

水热法是将有机或无机碳源和水或有机溶剂混合后转移至反应釜，通过加热使反应釜内产生高温高压制备碳点的一种方法。该方法的优点是一步即可将碳源碳化生成高荧光量子产率且在表面带有功能化基团的碳点，相较微波法[8]、电化学氧化法[9]等制备方法，水热法制备工艺较为简便，且制备出的碳点粒径较为均匀[10]。

在检测领域，碳点主要应用在金属离子、有机小分子、有机大分子、微生物等方面。目前，在金属离子、有机小分子、有机大分子检测领域，碳点被用作传感器的荧光检测主要有3种检测策略，即荧光关闭、荧光开启和荧光比率[11]。在荧光关闭检测策略中，溶液的变化会影响荧光信号，导致检测结果不准确；对于荧光开启检测策略，荧光开启的程度与分析物的浓度有关，荧光强度增加更易得到准确的检测结果；在荧光比率策略中，参考信号可以消除溶液变化引起的误差，其精度优于荧光开启策略。碳点传感器的有效性通常用检测限（limit of detection，LOD）、传感器的线性范围和淬灭比等参数表示。LOD是指可靠检测和测量的最低分析物浓度；传感器的线性范围表示碳点的荧光强度与分析物浓度范围的线性关系；淬灭比表示分析物淬灭碳点的能力，当淬灭比达到0时，碳点完全失去了光致发光性能[11-12]。碳点用于细菌的检测方法与金属离子、有机小分子、有机大分子的检测方法不同。在细菌的检测领域，首先利用碳点的荧光特性标记细菌，然后根据荧光强度与细菌数量的线性关系，最终计算出细菌的数量，达到检测的目的[13]。本文首先介绍水热法制备碳点，着重对碳点在检测方面的应用进行综述，并对水热法制备的碳点如何更好地应用于检测领域进行展望。

1 碳点的水热法制备

1.1 以有机溶液为溶剂制备碳点

Xu等[14]利用酒石酸和麸皮为双碳源，以二甲基甲酰胺为溶剂，在高压反应釜150℃下热处理8 h，制备出光致发光量子产率高达46%、粒径主要集中在4～6 nm、平均粒径为4.85 nm的绿色荧光发射碳点（如图1所示）。该碳点具有优良的化学稳定性和良好的荧光性能，且生物相容性好、细胞毒性低。以石墨烯量子点为研究对象，Zhang等[15]建立了一种简单的一锅法制备碳点。以二甲基甲酰胺作为氮的来源与溶剂，制备的氮掺杂石墨烯量子点在紫外灯照射（365 nm）下呈亮绿色发射。这种石墨烯量子点灵敏度高、重现性好、粒径均一、长期稳定性好。

图1 以酒石酸和麸皮为双碳源制备的绿色荧光发射碳点[14]

为合成简单廉价的碳点，Khaledian等[16]利用番茄汁为反应物，以无水乙醇为溶剂，在高温高压反应釜内220℃条件下反应2 h，所制备的碳点在485 nm有较强的荧光发射，其粒径小于30 nm，荧光量子产率为38%。通过该方法制备的碳点生物相容性好、绿色无毒，对有机磷毒物如二嗪农有较高灵敏度，因此可在该类物质的检测中较好应用。Yang等[17]采用同样的方法将柠檬酸和尿素溶于无水乙醇中，在高温高压反应釜内180℃条件下反应7 h，制得粒径在26 nm左右、荧光量子产率为9.47%的氮掺杂碳点。该碳点在pH 6～10的溶液中荧光强度变化不明显，在pH 7.4下易被邻苯二酚淬灭，表明基于该碳点的传感系统可以快速、灵敏、选择性地检测邻苯二酚。Xu等[18]以N-（2-氨基乙基）-3-氨基丙基三甲氧基硅烷为溶剂，以无水柠檬酸为反应物，在240℃下反应1 min，制得硅掺杂碳点（Si-CDs）。该碳点的粒径在2 nm左右，荧光量子产率为14%，荧光寿命为2.349 ns。该研究在辣根过氧化物酶依赖荧光响应的基础上，构建了一种新型的荧光传感系统，能有效地抑制Si-CDs在370 nm激发下470 nm处的荧光。这种方法不仅具有较好的灵敏度，而且避免了碳点与抗体之间复杂的生物结合步骤，大大地拓宽了该方法在食品安全监测领域的应用。

1.2 以水为溶剂制备碳点

碳点存在红色发射区域的激发和发射不足、抗离子干扰与抗光漂白能力差、抗强酸强碱能力差、量子产率低等问题，这严重限制了其在生物医学分析和治疗中的实际应用[19-26]。Yang等[21]将2，5-二氨基苯磺酸溶于蒸馏水，利用水热法在200℃高压反应釜中反应10 h，制得粒径3～7 nm的硫氮共掺杂红色发射碳点，在500 nm激发波长下测得碳点的绝对量子产率为2.67%。为进一步增强碳点在红色荧光区域的发射效应，Tao等[22]以聚丙烯酸和乙二胺为原料，利用反应釜在200℃下水热交联8h，制备了一种绝对量子产率高达44.18%、粒径分布在20～30 nm的新型聚合物碳点。通过交联和包裹荧光中心来降低运动自由度和提供溶剂化效应，从而提高了量子产率，促使该碳点向红色荧光发射区移动，这进一步丰富了交联增强发射效应的解释。

为解决碳点不耐金属离子干扰的问题，Zhang等[23]首次利用三磷酸腺苷，通过水热法在180℃的反应釜内反应10 h，制得平均粒径为3.8 nm的水溶性磷氮共掺杂碳点。制备的磷氮共掺杂碳点在365 nm紫外灯照射下发出明亮的蓝色荧光，荧光量子产率为9.8%，其可以抗金属离子、盐溶液和高离子强度环境的干扰，具有较高的生物相容性和良好的成像性能，可以应用于多功能复合材料体系中。

为提高碳点的抗光漂白、抗强酸强碱的能力，Liu等[24]以蛋氨酸和柠檬酸为原料，在200℃条件下的高温高压反应釜中水热反应3 h，制备了氮硫掺杂的平均粒径为5nm的蓝色荧光发射碳点（如图2所示），量子产率为13.8%，平均荧光寿命为3.67 ns。制备的碳点具有良好的荧光性能和抗光漂白性能，由于其表面上的羟基、羧基、氨基而具有很好的水溶性，抗强酸强碱能力强、离子强度高、稳定性好。

图2 以蛋氨酸和柠檬酸为原料制备的蓝色荧光发射碳点[24]

如何制备出高量子产率的碳点一直是研究者要解决的问题。杨焜[25]以无水柠檬酸为碳源，将乙二胺作为表面钝化剂，在200℃条件下通过一步水热法制备蓝色发射的碳点。该碳点荧光量子产率高达79.7%，荧光性能优异，生物相容性良好，可负载光敏剂用于肿瘤的光动力治疗。Hou等[26]对目前常用的柠檬酸-聚乙烯亚胺前体混合物的碳化工艺进行了简单而有效的改进，在高压反应釜330℃条件下水热处理6 h，制备了绿色发射的碳点，其具有很强荧光性能，接近定量荧光量子产率的上限。

2 碳点在检测方面的应用

2.1 金属离子的检测

利用部分金属离子对碳点荧光有淬灭作用的这一特性，Xu等[14]利用酒石酸和麸皮为双碳源经一锅水热法处理，制备出光致发光量子产率高达46%的绿色荧光发射碳点。利用Cu2+可淬灭该碳点荧光的作用，制备的绿色发射碳点可用于Cu2+检测。该碳点对Cu2+有很好的选择性和敏感性，证实了绿色荧光发射碳点对Cu2+的检测具有很高的准确性。Cu2+检测范围为0～0.5 mmol/L，LOD为0.050 7μmol/L。Fe3+是自然界重要的元素，也是人体必不可少的微量元素。Fe3+对碳点同样具有淬灭作用，Rao等[27]以无水柠檬酸和乙二胺为前体，利用水热法快速连续地大规模制备量子产率高达60.1%的碳点。该碳点可用于Fe3+的检测，其LOD为0.239μmol/L。为实现血清中Fe3+与L-半胱氨酸的共同检测，Yang等[21]以2，5-二氨基苯磺酸前体制备了硫氮共掺杂红色发射碳点，利用L-半胱氨酸与Fe3+的竞争性关系，该碳点可以快速识别和定量分析Fe3+和L-半胱氨酸，其中Fe3+的检测范围为0～30μmol/L（LOD为0.27μmol/L），L-半胱氨酸的检测范围为0～24μmol/L（LOD为0.14μmol/L）。利用该碳点对人血清样品中的Fe3+和L-半胱氨酸进行了检测，得到的结果令人满意。此外碳点还运用在Cr6+[28]、Sn2+[29]（如图3所示）等金属离子的检测。

图3 在开—关—开模式下测定Sn2+和L-赖氨酸的手性碳点探针的制备示意图[29]

2.2 有机小分子的检测

谷胱甘肽在代谢等方面发挥着重要作用[30-31]。Pan等[32]提出了一种基于控制碳点表面钝化程度的新型谷胱甘肽荧光传感器，制备的碳点对谷胱甘肽的检测范围为1.0～50.0μmol/L，LOD为0.943μmol/L。基于碳点的荧光传感器可作为分析检测生物环境、保健食品、药品和化妆品中谷胱甘肽的有效工具。为提高对谷胱甘肽检测的灵敏度与抗干扰能力，Song等[33]经一步水热法制备了具有pH依赖性和可变色荧光特性的多功能氮硫共掺杂碳点，可以从半胱氨酸、同型半胱氨酸等其他硫醇中检出谷胱甘肽，可作为高选择性检测谷胱甘肽的探针。该碳点在0～50μmol/L和50～100μmol/L范围内存在2个良好的线性关系，LOD为6.7μmol/L。炭疽杆菌有很高的致死率，因此对其进行高效精准的检测至关重要。基于此，Li等[34]开发了一种新型的、灵敏的无标签传感器，用于检测生物威胁剂炭疽的生物标志物二苯胺酸，使用一个荧光“关—开”碳点-铜（Ⅱ）系统。以多巴胺为前体，利用水热法制备了量子产率为24.7%的荧光碳点，铜（Ⅱ）使碳点荧光淬灭，而二苯胺酸与铜（Ⅱ）结合使得碳点荧光恢复。该碳点对二苯胺酸的检测范围为0.25～20μmol/L，LOD为0.079μmol/L。Mao等[35]制备了一种新型的、环保型分子印迹聚合物，并将其作为分子识别元件，构建了多巴胺荧光传感器。在有机硅烷中，通过水热法制备了强荧光发射的碳点，对多巴胺的检测范围为25～500 nmol/L，LOD为1.7 nmol/L。α-鹅膏毒素可使患者在短时间内死于急性肝衰竭，基于此，Feng等[36]提出了一种利用水热法制备的碳点嵌入特异性分子印迹聚合物用以直接检测血清α-鹅膏毒素的新方法，碳点的荧光强度与α-鹅膏毒素浓度在0.05～4.0μg/mL范围内存在线性关系，LOD为15 ng/mL。

2.3 有机大分子的检测

碳点作为免疫传感器已成为检测抗原和疾病标志物并用于癌症诊断的重要手段[37]。He等[38]利用精氨酸和柠檬酸为前体通过水热法制备碳点，碳点作为标记物成功地应用于前列腺特异性抗原的检测，LOD为0.22 ng/mL。该碳点还可用于检测癌胚抗原，LOD为0.56 ng/mL。此方法为构建一个灵敏、通用的检测平台提供了一种有效的途径。Zhang等[15]将二甲基甲酰胺作为溶剂和氮的来源，制备出氮掺杂石墨烯量子点。利用纸基电化学发光免疫分析法，以石墨烯量子点作为纸基电化学发光标记、α-胎蛋白抗原作为模型蛋白，通过种子介导生长法制备了一种新型纸工作电极，可成为一种很有前景的抗体附着平台（如图4所示）。其对α-胎蛋白抗原线性检测范围为0.005～100 ng/mL，LOD为1.2 pg/mL。为实现对非传染性疾病标志物的测定，Othman等[39]提出了一种基于氮掺杂碳点的高选择性、快速、环保的核基质蛋白22（NMP22）荧光免疫分析技术。采用水热法，以柠檬酸和尿素为原料，合成了高量子产率的氮掺杂碳点。单克隆抗体通过酰胺化技术标记氮掺杂碳点，在最佳条件下荧光强度与NMP22浓度在1.3～16.3 ng/mL范围内呈线性关系，LOD为0.047 ng/mL。该方法可用于人体尿液中NMP22的测定，回收率为96.50%～103.61%。这些结果为非传染性疾病作为免疫分析荧光标记的潜在用途提供了可能。

图4 基于种子介导生长法和纸基电化学发光免疫分析法的免疫传感器制备工艺[15]

2.4 微生物的检测

快速鉴别大肠杆菌[40-42]和金黄色葡萄球菌对保障人体健康至关重要。Zhao等[43]利用水热法制备了一种基于pH敏感的碳点，用于糖代谢触发的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌鉴定。制备的碳点荧光强度在pH 4.0～7.0的酸性范围内与溶液的酸碱度呈线性关系，利用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在糖代谢能力方面存在的差异，该碳点可以产生可区分的荧光信号，用于进一步区分大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（如图5所示）。在葡萄糖存在下，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的LOD分别为21和33 cfu/mL，在乳糖存在下，大肠杆菌的LOD为762 cfu/mL。张春林等[44]以富含氨基的葡萄糖制备出氨基化碳点，通过1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺（EDC/NHS）化学偶联法构建碳点与大肠杆菌抗体的荧光探针，可以实现对大肠杆菌O157∶H7的快速检测。为实现人体尿液中的鲍曼不动杆菌的精准检测，Bahari等[45]开发出一种基于荧光共振能量转移的新颖的比率型荧光适体传感器，以邻苯二胺碳点（o-CDs）、氮掺杂碳点为能量供体，氧化石墨烯为能量受体，用于鲍曼不动杆菌的灵敏性和选择性检测。负载在氧化石墨烯边缘的氮掺杂碳点表现出荧光淬灭，并且随着修饰的o-CDs与核酸适配体（ssDNA）在氧化石墨烯表面吸附，o-CDs的荧光被有效淬灭。当ssDNA与鲍曼不动杆菌特异结合时，释放氧化石墨烯中的o-CDs-ssDNA，恢复o-CDs的荧光信号，而氮掺杂碳点的荧光强度变化不大，其荧光强度在比值荧光分析中作为参考信号。荧光强度比（I550 nm/I440 nm）为2.0～10.0，细菌浓度为2.0×103～4.5×107cfu/mL，最低LOD为3.0×102cfu/mL。该方法证明了所研制的适体传感器用于人体尿液中鲍曼不动杆菌选择性检测的可行性。

图5 碳点辨别并检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌原理图[43]

3 总结与展望

综上所述，通过水热法制备的碳点具备优异的荧光性能，已在金属离子、有机小分子、有机大分子、微生物等领域被广泛应用。但目前制备出的碳点大多数为蓝色发射碳点且量子产率有待提高，因此期望通过改变分子前体或者掺杂氮、硫等元素，获得多色发射碳点或者获得荧光性能更强、荧光量子产率更高的碳点。而且碳点的抗酸碱能力弱，在强酸强碱的环境下碳点的荧光强度大大降低，后期希望开发出耐酸碱的碳点，使碳点可应用于强酸强碱的环境。碳点在荧光检测方面的应用还处于起步阶段，对物质识别响应的灵敏度和抗干扰能力需进一步改善，检测范围有限而且使用范围也需要拓展，而不是局限于少数几种模型分子，后续可以尝试构建膜载体[46-47]、胶体体系[48]、核壳包覆[49]、加入掺杂物[50]增加碳点的荧光性能，或者利用微流控技术[51-52]实现多通道的快速检测能力，使碳点可作为优异的标记物用于金属离子、有机小分子、有机大分子、微生物等快速精准的检测。在有机大分子方面还存在检测时间过长、无法实现快速检测等问题，期望在后续的研究中通过加入一些试剂加速反应，压缩检测时间实现快速检测。在细菌检测方面期望开发出既能实现细菌精准检测又具有杀菌抑菌功能的碳点，以实现更好的应用价值。