小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量测定的不确定度评定

袁梦 胡莎 葛文静

摘 要：目的：评定高效液相色谱-串联质谱仪测定小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的不确定度。方法：依据《粮油检验 主要谷物中16种真菌毒素的测定 液相色谱-串联质谱法》（LS/T 6133—2018）进行实验，按照《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）分析测定过程的不确定度来源，建立数学模型计算合成不确定度和扩展不确定度。结果：小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量为1 930 μg/kg，其扩展不确定度256 μg/kg（P=95%，k=2）。结论：影响本次测定过程的不确定度主要包括重复检测、标准溶液纯度及配制、样品制备、DON同位素内标和高效液相色谱-质谱联用仪。仪器引入的不确定度分量对本次评定影响最大。

关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇;高效液相色谱-串联质谱仪;不确定度

真菌毒素广泛的存在于食品和饲料中，全球都普遍面临着真菌毒素污染的重大问题，严重威胁着人类和动物的生命安全[1-2]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是一种是单端孢霉烯族毒素，具有较强的热抵抗力和耐酸性[3]，食用了DON污染的食物后，可对人和动物的肠道、大脑及神经系统产生毒害作用，使动物产生厌食和呕吐反应等急性中毒症状[4]，严重时损害造血系统造成死亡[5-7]，因此DON又称呕吐毒素[8-11]。

测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。测量不确定度通常包括很多分量[12]。其中一些分量是具有统计性的，另一些分量是具有非统计性的。为得到准确、可靠和科学的实验数据，不确定度的评定具有重要作用。DON含量的定量分析结果应包括测量值和测量不确定度，能更准确地反映脱氧雪腐镰刀烯醇的浓度。本次实验采用《粮油检验 主要谷物中16种真菌毒素的测定液相色谱-串联质谱法》（LS/T 6133—2018）[13]测定小麦中DON的含量，参照《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[14]，建立DON不确定度的评定方法，分析在检测过程中产生的不确定度分量[15-16]，对各分量进行计算得到合成标准不确定度、扩展不确定度，以及各分量的相对贡献，能够为更准确、科学的评定检测结果提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1290-6460超高液相色谱-串联质谱仪（美国Agilent公司）;DT300A百分之一分析天平（江苏省意欧仪器仪表有限公司）;3-18ks离心机（德国Sigma公司）;C18色谱柱（Agilent公司，100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。

DON标准液浓度（浓度为100.6 μg/mL，不确定度为

1.2 μg/mL，Pribolab公司）;13C15-脱氧雪腐镰刀烯醇同位素内标（13C15-Deoxynivalenol，13C15-DON，浓度为25 μg/mL，不确定度为0.2 μg/mL，Pribolab公司）;乙腈、甲醇、乙酸铵、乙酸（分析纯，美国Merck公司）。

样品提取液：乙腈-水-乙酸混合液（70︰29︰1，V︰V︰V，自行配制）。

1.2 实验方法

1.2.1 液相色譜-串联质谱仪色谱条件

仪器条件柱温35 ℃;进样量：1 μL;流速：0.20 mL/min;流动相：A为1%乙酸溶液和5 mmol/L乙酸铵的水溶液，B为甲醇;流动相梯度洗脱条件见表1。

1.2.2 高效液相色谱-串联质谱仪质谱条件

电离模式：电喷雾电离源（ESI）负离子模式;毛细管电压：4 kV（+），3.5 kV（-）;脱溶剂气温度：350 ℃;脱溶剂流量：10 L/min;碰撞气体：氩气;扫描模式（scan type）：多反应监测模式（MRM）;驻留时间：30 ms，质谱条件参数见表2。

1.2.3 标准溶液配制

配制标准溶液的稀释液为乙腈-水-乙酸（35︰64.5︰0.5，V︰V︰V）混合液。

100.6 μg/mL的DON标准液配制得到10 μg/mL的DON标准储备液，然后经过稀释得到1.5 μg/mL的DON标准工作液，稀释1.5 μg/mL的DON标准液得到一系列浓度标准工作液，浓度分别为37.5 μg/mL、75 μg/mL、150 μg/mL、375 μg/mL和1 500 μg/mL的标准溶液。准确吸取0.8 mL的13C15-DON内标液于10 mL容量瓶中，定容至刻度线，得到2 μg/mL的13C15-DON同位素内标标准工作液。

1.2.4 样品前处理

粉碎小麦样品，过500 μm孔径试验筛，混匀。准确称取5 g（精确到0.01 g）小麦样品于50 mL离心管，加入20 mL提取液，涡旋或振荡提取30 min，然后用离心机6 000 r/min离心10 min，吸取0.5 mL上清液于1.5 mL离心管中，加入0.5 mL超纯水，旋涡混匀，在4 ℃以下12 000 r/min离心10 min，上清液过0.2 μm的聚四氟乙烯滤膜，收集滤液A。

1.2.5 添加13C15-DON同位素内标液

准确吸取180 μL滤液A或者标准系列工作曲线于进样小瓶中，加入20 μL之前配制好的13C15-DON同位素内标工作液，旋涡混匀，上机待测。

1.2.6 样品检测与计算

按照上述方法以及仪器条件测定样品，经过液相色谱-串联质谱联用仪上机检测，以DON系列标准工作液各点浓度与13C15-DON内标液浓度之比为横坐标（x轴），以DON系列标准工作液各浓度的峰面积与13C15-DON内标液的峰面积之比为纵坐标（y轴），以各个数值点做最小二乘线性拟合做工作曲线（1）：

按式（2）计算待测样品中DON浓度：

式中：X-待测样品中DON含量，单位为μg/kg;x-待测样品溶液中待测毒素与内标的浓度比;r-待测毒素对应的内标浓度，单位为μg/kg;V-加入提取液的体积，20 mL;f-提取液稀释因子，为2;m-待测样品称量质量，单位为g。

2 结果与分析

2.1 测量不确定度的来源分析

根据CNAS-GL006-2019化学分析中不确定度的评估指南，上述数学模型和检测方法操作步骤，测定小麦中DON的不确定度来源于以下几个方面：待测样品检测重复性引入的不确定度;标准曲线系列工作液配制过程引入的不确定度;标准曲线系列工作液拟合产生的不确定度;样品制备前处理过程中引入的不确定度;内标引入的不确定度;检测方法及仪器设备引入的不确定度。

2.2 各不确定度分量的分析和评定

2.2.1 重复检测引入的不确定度评定

重复检测引入的不确定度属于A类不确定度。实验室日常检测，无法将所有的样品进行前处理，这就会引起检测结果的不准确，因此只能通过混匀粉碎混匀，尽量确保样品的均匀性，增加检验次数，尽量减少样品的不均匀性引起的实验误差。为了评定重复性检测的不确定度分量，分别称取6份小麦样品，经过前处理上机检测计算得到质控样品的浓度，结果见表3。

6个试样测定结果平均值=1 930 μg/kg，单次测定的标准偏差为：

n=6，重复性检测引入的标准不确定度为：

因此，重复测定带来的平均值相对不确定度为：

2.2.2 标准溶液引入的不确定度评定

标准溶液引入的不确定度来源主要包括标准品纯度引入的相对标准不确定度、配置系列标准曲线工作液时产生的相对标准不确定度、不同浓度的标准曲线线性拟合产生的相对标准不确定度。

（1）标准溶液纯度引入的不确定度评定。经查本次实验使用的DON标准液标品证书，DON标准液浓

度为100.6 μg/mL，其扩展不确定度为1.2 μg/mL（包含因子k=2），则标准溶液的相对不确定度为

（2）配制系列标准曲线工作液时产生的不确定度评定。用1.00 mL移液管移取1.00 mL的100.6 μg/mL的DON标准液于10 mL容量瓶，定容至刻度线，得到10 μg/mL的DON标准储备液。用有1 mL移液枪分两次移取1.5 mL的DON标准储备液于10 mL容量瓶，定容至刻度线，得到1.5 μg/mL 的DON标准工作液，分别移取2.5 mL、1 mL、0.5 mL、0.25 mL的1.5 μg/mL DON标准工作液标准液到10 mL容量瓶中，分别得到37.5 μg/L、75 μg/L、150 μg/L、375 μg/L和1 500 μg/L的标准液。经查10 mL容量瓶20 ℃时最大允误u=0.020 mL，;1 mL移液管20 ℃时最大允差为u=0.008 mL，，1 mL移液枪20 ℃时相对最大允许误差为u=1%，，配制过程不同移液器相对不确定度见表4。

配制好工作液标准曲线，用200 μL的移液枪取180 μL的标准液和20 μL内标标准液，200 μL的20 ℃时最大允误u（200 μL）=1.5%，u（20 μL）=4.0%，，重復操作5次，配制一个含内标标准液的相对标准不确定度。

因此，配置不同浓度的标准曲线工作液带入的不确定度为：

标准溶液引入的不确定度为：

（3）不同浓度的标准曲线线性拟合产生的不确定度评定。按照方法对不同浓度的DON系列标准液共检测5次，根据表5，测得的数据进行线性拟合得到线性方程y=1.034 24x+0.036 26，相关系数R=0.999 97，参与标准曲线的点n=5，标准曲线的重心（2.137 5，2.246 9），即=2.137 5。

残余标准偏差为：

待测样品上机检测6次，由标准曲线计算得到待测样品平均DON浓度为，则通过标准曲线拟合引入的标准不确定度为：

SR为残余标准偏差，b为标准曲线方程斜率，p为标准溶液的测定总次数，n为待测样品液测定次数，为待测样品液与内标浓度之比的平均值;为标准曲线各点浓度浓度与内标浓度之比平均值;ci为标准曲线上各点浓度与内标浓度之比;计算得到u=0.012 05，因此相对不确定度为。

2.2.3 样品制备过程中引入的不确定度评定

（1）待测样品称量过程引入的不确定度。本实验采用百分之一天平称取样品5 g，经查天平的计量检定证书得到最大允差为0.5e，其中e=0.1 g，因此最大允差为0.05 g，，标准不确定度，相对不确定度。

（2）待测样品前处理过程中移液枪引入的不确定度评定。待测样品前处理过程中使用5 mL移液枪4次，5 mL移液枪20 ℃时最大允许误差为u=0.6%，，相对不确定度 4;使用1 mL移液枪2次，1 mL移液枪20 ℃时相对最大允许误差为u=1%，，相对不确定度（矩形分布）。

待测样品称量制备前处理过程产生的相对不确定度：

2.2.4 13C15-DON同位素内标引入的不确定度评定

经查13C15-DON同位素内标标准品证书得到扩展不确定度u=0.2 μg/mL，k=2，同位素内标的标准不确定度，同位素内标的相对不确定度。

2.2.5 高效液相色谱-质谱联用仪引入的不确定度评定

经查高效液相色谱-质谱联用仪仪器计量鉴定认证证书，仪器的扩展不确定度是u=11%，k=2，因此此仪器的相对不确定度。

2.3 内标法测定小麦中DON含量的合成不确定度

高效液相色谱-质谱联用仪内标法测定小麦中DON的不确定度分量包括重复检测引入的不确定度、标准溶液引入的不确定度、样品制备过程中引入的不确定度、DON同位素内标引入的不确定度、高效液相色谱-质谱联用仪引入的不确定度。合成DON含量的相对标准不确定度：

各不确定度分量对合成相对标准不确定的相对贡献大小见表6。

由表4可知，仪器引入的不确定度相对贡献最大，其次是配制标曲、样品前处理过程、重复性检测、同位素内标引入的不确定度，标准曲线线性拟合引入的不确定度最小。

取置信水平为95%，k=2，因此扩展不确定度为U=k×u×c=2×0.066 40×1 930=256 ug/kg。高效液相-质谱联用仪内标法测定小麦中DON的含量结果为（1 930±256）μg/kg（k=2）。

3 结论

高效液相色谱-质谱联用仪内标法测定小麦中DON含量的不确定度评定最终结果表示为（1 930±256）μg/kg（k=2），扩展不确定度为256 μg/kg。本次测定过程的不确定度分量中，高效液相色谱-质谱联用仪引入的不確定度分量为0.055 00，对合成不确定度的影响最大，其次是配制标曲、样品前处理过程、重复性检测、同位素内标引入，而标准曲线线性拟合引入的不确定度分量为对结果的影响最小。

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