基于生物信息学及分子对接研究温阳振衰颗粒治疗慢性心力衰竭的潜在分子机制

姚昆鹏 刘起立 石静 蔡子杰 蔡虎志 陈新宇

〔摘要〕 目的 利用生物信息學方法及分子对接技术预测温阳振衰颗粒治疗慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）的活性成分、作用靶点及相关生物学途径。方法 利用TCMSP、BATMAN-TCM数据库筛选温阳振衰颗粒的活性成分及药物潜在靶点，应用GeneCards、PharmGkb、TTD、DrugBank平台检索CHF的疾病靶点，采用Cytoscape 3.7.0软件构建“成分-靶点”网络图，运行STRING平台进行靶蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）分析，运用R语言数据包进行基因本体功能富集（gene ontology， GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomics， KEGG）富集分析，预测其作用机制，最后运用AutoDockVina和PyMol软件对温阳振衰颗粒中的关键活性成分与PPI中的核心蛋白进行分子对接验证。结果 共筛选温阳振衰颗粒有效成分145种，涉及靶标238个。“药物-成分-靶点”图中筛选出关键活性化合物204个，其干预的PPI网络主要涉及PTSG2、ESR1、CALM3等核心蛋白，GO及KEGG富集分析结果显示温阳振衰颗粒干预慢性心力衰竭主要涉及氧化应激反应、Ca2+稳态调节、细胞内能量转运等多种生物学途径以及MAPK信号通路、p53信号通路、PI3K-Akt信号通路等相关通路。分子对接验证提示槲皮素与核心靶蛋白JUN结合情况最佳，JUN是温阳振衰颗粒中关键化学成分结合活性最优的靶蛋白。结论 温阳振衰颗粒中槲皮素、豆甾醇、山柰酚等多种关键有效成分可能作用于JUN、MAPK3、STAT3等多种核心靶蛋白，发挥干预CHF的药理作用。

〔关键词〕 温阳振衰颗粒;慢性心力衰竭;生物信息学;分子对接;分子机制

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.09.010

Mechanism of Wenyang Zhenshuai Granule in Treatment of Chronic Heart Failure

Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

YAO Kunpeng1， LIU Qili1， SHI Jing1， CAI Zijie1， CAI Huzhi2， CHEN Xinyu1，2*

（1.Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective Bioinformatics method and molecular docking technology were used to predict the active components， targets and related biological pathways of Wenyang Zhenshuai Granule in the treatment of chronic heart failure （CHF）. Methods TCMSP and BATMAN-TCM database were used to screen the active components and potential drug targets of Wenyang Zhenshuai Granule. GeneCards， PharmGkb， TTD and DrugBank platforms were used to search the disease targets of CHF. Cytoscape 3.7.0 software was used to construct the "component-target" network diagram. STRING platform was used to analyze the protein-protein interaction （PPT）. R language data package was used to enrich gene ontology （GO） function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） to predict its mechanism. AutoDockVina and PyMol software were used to verify the molecular docking of key active components in Wenyang Zhenshuai Granule and core proteins in PPI. Results A total of 145 effective components of Wenyang Zhenshuai Granule were screened， involving 238 targets. A total of 204 key active compounds were screened out from the "drug-component-target" diagram. The PPI network intervened mainly involves core proteins such as PTSG2， ESR1 and CALM3. GO and KEGG enrichment analysis results showed that the intervention of Wenyang Zhenshuai Granule on CHF mainly involved multiple biological pathways such as oxidative stress response， Ca2+ homeostasis regulation， intracellular energy transfer， and MAPK signaling pathway， P53 signaling pathway， PI3K-Akt signaling pathway. Molecular docking verification showed that quercetin had the best binding with the core target protein JUN， and JUN was the target protein with the best binding activity for the key chemical components in Wenyang Zhenshuai Granule. Conclusion Quercetin， stigmasterol， kaempferol and other key active ingredients in Wenyang Zhenshuai Granule may act on JUN， MAPK3， STAT3 and other core target proteins， and play a pharmacological role in the intervention of CHF.

〔Keywords〕 Wenyang Zhenshuai Granule; chronic heart failure; bioinformatics; molecular docking; molecular mechanism

慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）是各种心脏结构或功能性疾病导致心室充盈和（或）射血功能受损而引起的一组综合征[1]。据中国心血管健康与疾病报告编写组推算，截至2021年，我国35～74岁成年人中约有890万心衰患者，且心衰的患病率有逐年上升的趋势[2]。由于慢性心力衰竭的患病率与死亡率较高，业已成为严重危害人民健康的一类心血管疾病。目前CHF的治疗以药物治疗（如利尿剂、ACEI/ARB类药物、β受体阻滞剂等）及手术治疗（如主动脉内球囊反搏术、心脏移植术、起搏器植入术等）为主要手段，药物治疗仍是CHF治疗的重点和难点[3]。中医药具有疗效高、副作用低的特点，在CHF的治疗中具有广阔前景[4]。

温阳振衰颗粒是由湖南中医药大学第一附属医院陈新宇教授研制的院内制剂。前期研究[5-6]表明，温阳振衰颗粒可明显缓解患者症状，改善CHF患者的心功能。生物信息学是利用系统生物学与计算机技术进行研究的新方法。其具备从庞大、复杂的生物信息数据中挖掘出有价值的医学信息的特点，对于新药研发、揭示复杂的生物学过程和病理状态具有一定的意义[7]。本文利用生物信息学方法及分子对接技术，探讨温阳振衰颗粒治疗CHF的作用机制，为后续的药理学及基础研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1  有效成分筛选及作用靶标预测

温阳振衰颗粒为湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，由7味中药组成：制附子、干姜、茯苓、红参、麦冬、五味子、甘草。利用中药系统药理学平台TCMSP数据库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索上述6味中药的有效成分及相应靶点，以口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%和类药性（drug-likeness， DL）≥0.18作为筛选条件;BATMAN-TCM在线分析平台（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），设定预测候选目标（包括已知目标）得分不小于每个成分得分分界的20%，Adjust P-value设为0.05，获取麦冬的活性成分和相应潜在靶点。使用UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）获取靶点官方基因名。

1.2  疾病靶点的收集

使用“chronic heart failure”作为关键词，检索GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD （http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）疾病数据库，获取CHF的疾病靶點。将在GeneCards中获得的疾病靶点按照相关性评分（relevance score）≥1进行过滤。

1.3  药物-疾病核心作用基因筛选

为明确温阳振衰颗粒主要活性成分的预测靶点与CHF疾病靶点的相互作用，通过Perl软件，将温阳振衰颗粒的预测靶点与CHF的相关靶点取交集，获取药物-疾病关键作用基因，得到药物靶点与疾病差异基因的交集。将药物靶点-疾病交集汇总成文件导入Cytoscape 3.8.0 软件，运用其Network Analyzer功能，构建药物-成分-靶点图。

1.4  靶蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建与拓扑分析

将获得的交集靶基因导入STRING平台（https：//string-db.org/），物种设定为“Homo sapiens”，combined score（最低互动得分）设置为0.9，并去除游离节点，得到蛋白互作网络图。由此得到温阳振衰颗粒对治疗CHF中排名前列的核心作用基因。利用Cytoscape 3.8.0 软件，下载CytoNCA，进一步根据其网络中心度进行拓扑分析。

1.5  基因本体功能富集（gene ontology， GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomics， KEGG）富集分析

利用R语言DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview等相关程序包对交集基因进行基因本体功能富集与京都基因与基因组百科全书富集分析，GO功能富集分析描述了基因产物可能形式的分子功能，参与的生物过程和所处的细胞环境。KEGG通路富集分析是指通过将已知的基因组注释信息进行分类，得出最显著的生物学过程。由此可以预测温阳振衰颗粒活性成分治疗CHF的潜在作用机制。选择显著富集的生物学过程（biological process， BP）、细胞成分（cell component， CC）、分子功能（molecular function， MF）前10项绘制柱状图;选择显著富集的前30条通路绘制气泡图。

1.6  分子对接

选择药物-成分-靶点中排名前3的活性化合物作为小分子配体：槲皮素（quercetin）、豆甾醇（stigmasterol）、山柰酚（kaempferol）。与PPI网络拓扑分析后所获取的19个关键靶点的前3个靶点蛋白，即JUN、MAPK3、STAT3进行分子对接。在PubChem CID 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载有效成分的2D结构的SDF文件，利用PDB数据库（http：//www1.rcsb.org/）下载核心基因相关蛋白的 2D 结构，运用PyMOL软件移除靶蛋白中的配体和非蛋白分子（如水分子），再保存为pdb格式文件。再使用AutoDock Tools1.5.6 软件将晶体结构进行加氢处理，并且对蛋白质进行电荷计算，所有配体和受体文件均保存为pdb格式。使用Autodock Vina软件进行分子对接，并计算最低结合能，使用PyMol 软件生成分子对接模型图。

2 结果

2.1  有效成分筛选及作用靶标预测

在TCMSP数据库中以OB≥30%，DL≥0.18为条件进行温阳振衰颗粒的有效成分筛选，共检索到化合物145种，其中附子21种、干姜5种、茯苓15种、红参4种、五味子8种、甘草92种。使用BATMAN-TCM在线分析平台进行补充，获取麦冬化合物18种。利用Uniprot数据库对有效成分对应的靶点进行标准化转换，选择“Reviewed”“Human”，下载标准靶点名。通过匹配并删除重复值，最终获得靶点238个。

2.2  疾病靶点的收集

检索GeneCards、PharmGkb、TTD、DrugBank疾病数据库，最终得到CHF靶点个数分别为10 151、290、16、13、13个，筛选并去除重复值后得到靶点10 186个。药物靶点与疾病靶点交集为204个。见图1。

2.3  筛选药物-疾病核心作用基因

将温阳振衰颗粒的预测靶点与CHF的相关靶点取交集，再导入Cytoscape 3.8.0软件，运用其内置的Network Analyzer功能，构建“药物-成分-靶点”网络图。根据连接度（degree）调节网络中节点（靶基因）的面积大小、颜色深浅和排序;最低互动得分的大小则通过连线的粗细表示，最终得到“药物-成分-靶点”网络图（图2）。图中共计522个节点，2 005条边。由图2可知，甘草、麦冬的有效成分中对应最多的相关靶基因，有效成分槲皮素、豆甾醇、山柰酚分别与130、97、54个靶点相关。其中，PTSG2 （92个）是有效成分对应靶点数量最多的基因，其次是ESR1 （80个）和CALM3 （71个）。

2.4  PPI网络构建与拓扑分析

将筛选的温阳振衰颗粒与CHF的204个共同靶点提交至STRING平台，物种先定位“Homo sapiens”，再将最低互动得分设置为0.9，去除游离节点后，最终得到温阳振衰颗粒干预CHF的PPI网络。将STRING数据库生成的文件通过Cytoscape 3.8.0可视化（图3）。该网络中涉及174个节点，801条边。通过Cytoscape 3.8.0的CytoNCA进行拓扑分析，选择相关指标：介度中心性（betweenness centrality， BC）、接近中心性（closeness centrality， CC）、借助度中心性（degree centrality， DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality， EC）、局部边连通性（local average connectivity， LAC）和网络中心性（network centrality， NC），对基因相关指标进行筛选，选择大于所有指标中位数的基因进行后续分析，经过2次筛选，最终获得核心基因19个，按照DC进行排序，前10位的核心基因分别是JUN、MAPK3、STAT3、MAPK1、FOS、MAPK1、MYC、AKT1、ESR1。见图4。

2.5  GO与KEGG富集分析

利用R语言Dose、ClusterProfiler、enrichplot、pathview、ggplot2等相关程序，将温阳振衰颗粒204个潜在靶点进行基因富集分析，得到GO富集条目2 777个，其中包括2 445个生物过程、94种细胞成分和238种分子功能。KEGG通路共计183条。各选取BP、CC、MF排名前10的GO条目繪制柱状图，取KEGG前30的条目绘制气泡图（图5）。通过查阅文献，剔除与慢性心衰完全无关的条目，在GO富集中发现氧化应激反应、Ca2+稳态调节、细胞内能量转运、急慢性炎症反应、线粒体膜通透性调节、儿茶酚胺释放、心肌细胞表型改变等生物过程均在温阳振衰颗粒治疗CHF中发挥重要作用。KEGG富集分析显示，与CHF相关的通路主要有MAPK信号通路、p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、cAMP信号通路、mTOR信号通路等。见图6。

2.6  分子对接

选取“药物-成分-靶点”网络中与靶点互动关系最为密切的前3个主要活性化合物作为小分子配体：槲皮素、豆甾醇、山柰酚。与PPI网络拓扑分析后所获取的19个关键靶点的前3个靶点蛋白，即JUN、MAPK3、STAT3进行分子对接。使用Autodock Vina软件进行分子对接，并计算各个蛋白与小分子配体的最低结合能。

使用PyMol软件进行可视化分子对接模式图，结果显示，各化合物与蛋白对接的结合能均小于

-7.0 kcal·mol-1，说明各化合物与蛋白能结合较紧密。与JUN和MAPK3亲和力最高的均为槲皮素，与STAT3亲和力最高的为山柰酚和槲皮素。见表1和图7。

3 讨论

CHF并非中医传统病名，中医根据CHF的发病症状，将其归结为“心水”“水肿”“胸痹”“心悸”等病名[8]。中医学认为，CHF的病性多属本虚标实，本虚为阳气亏虚为主，标实则以水饮、痰浊、血瘀为主[9]。对于CHF的治疗，中医学多以温阳利水法、益气健脾法、益气活血法、益气养阴法、清热解毒法拟方遣药[10]。温阳振衰颗粒为湖南中医药大学第一附属医院陈新宇教授研发的中药成方制剂，药物为制附子、干姜、茯苓、红参、麦冬、五味子、甘草，秉承温阳利水、益气养阴之法，由仲景名方参附汤合生脉散化裁而来。经临床研究[5-6]表明，温阳振衰颗粒可显著减轻患者临床症状，提高CHF患者生活质量，对于CHF之阳虚水泛证具有显著作用。方中附子温通阳，暖命门，温坎水，破阴凝，为君药。现代药理学研究表明，附子保护心肌的作用可能是通过调节心肌细胞能量代谢及钙稳态来实现的[11]。红参性微温、味甘，为人参蒸制后干燥者，具有大补元气、复脉固脱之功，扶阳先益气，取“无形之气急当速固”之意。红参中所含人参皂苷成分激活脂肪细胞系中STAT3/ PPARg/CEBPa信号通路，在体外发挥促进能量代谢的功效[12]。干姜与附子合用，回阳立效，具有显著的抗心衰作用，其机制可能与升高心肌组织cAMP、PKA含量有关[13]。茯苓健脾渗湿，补后天脾土，其与干姜配伍，则土得火生，中焦阳气得以上济胸阳。研究[14]表明，茯苓具有对抗大鼠心肌损伤的作用，其机制与激活MAPK信号通路，调节下游ERK1/2、JNK、p38蛋白水平相关。麦冬养阴生津，配伍五味子，一滋一敛，敛阴而固阳，仿“生脉散”而立，恰合景岳之“阳得阴助则生化无穷”。药理研究[15]表明，麦冬可下调IL-6、TNF-α、IL-1β等多种炎性蛋白，降低慢性心衰大鼠的炎症刺激及氧化应激水平。五味子素具有促进心肌组织的恢复的功效，减轻脂多糖诱导的心肌细胞损伤，其机制是通过下调Smad3，从而调节下游的JNK及NF-κB蛋白，促进心肌细胞的修复[16]。结合课题组前期研究，秉承于“阳主阴从”理论化裁的温阳振衰颗粒，其作用可能是通过介导MAPK、p53、PI3K-Akt、NF-κB、cAMP等多条信号通路，调节下游JUN、MAPK3、STAT3、MAPK1、FOS、MAPK1及IL-6等多种蛋白，从而减轻炎症刺激，降低心肌氧耗，改善能量代谢，进一步抑制心肌细胞凋亡，延缓心室重塑。

温阳振衰颗粒是湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，其疗效与安全性已得到实践证明，然而其具体作用机制并不完全明晰。本研究采用生物信息学分析及分子对接技术，对温阳振衰颗粒干预CHF进行分子层面的探讨。在CHF的病理生理学过程中，心肌细胞凋亡、心脏结构改变、心肌能量代谢障碍、心肌兴奋-收缩耦联障碍等被认为是主要的病理机制[17-18]，目前对于CHF的研究主要集中于细胞表型改变、能量代谢障碍等方面。结合相关文献文献，笔者发现，本研究所得出的关键靶点、通路与CHF的发生发展有密切联系。实验表明，在CHF大鼠模型中，通过激活TGF-β信号通路，上调TGF-β1/Smad2/3信号转导，c-JUN的表达随之增加，进一步诱导了LOX的表达，从而加剧大鼠心肌纤维化[19]。炎症刺激、氧化应激等作用，使得心肌细胞的自噬水平增高，并通过代偿维持其细胞活力。然而，过度自噬引起心肌细胞数量的绝对不足，加重心肌细胞的病理性代偿，最终加速CHF的病程[20]。在慢性心衰大鼠模型中对ERK1/2含量进行检测，发现ERK1/2水平与体内炎症水平及心肌细胞的自噬程度呈正相关，这提示ERK1/2可能与CHF的进程呈正相关[21]。进一步研究[22]表明，肾素-血管紧张素-醛固酮（renin angiotensin aldosterone system， RAAS）系统的激活与MAPK信号通路的激活呈正相关。接受手术干预后，MAPK通路受到抑制，NF-κB p65/IL-1β/TNF-α蛋白表达降低，提示MAPK/NF-κB/PI3K-Akt信号通路共同参与RAAS系统的激活，介导CHF的神经-体液调节[23]。此外，一项对大鼠心肌纤维化的研究[24]发现，当PI3K-Akt通路激活时，mTOR的磷酸化水平相应增高，心肌纤维化加剧，心脏进一步功能受损。而当PI3K-Akt抑制剂干预时，mTOR磷酸化水平随之降低，心肌纤维化水平得到逆转。

综上所述，温阳振衰颗粒主要成分及关键靶点可能通过激活/抑制MAPK、P53、PI3K-Akt、NF-κB、cAMP、mTOR等信号通路，调节下游JUN、MAPK3、STAT3、MAPK1、FOS、MAPK1、MYC、AKT1、ESR1、TNF-α、IL-1β、IL-6、Bax、Bcl-2、Caspase 3等蛋白表达，从而发挥抗RAAS激活、抗心肌细胞凋亡与自噬、抗心肌纤维化等作用，最终达到干预CHF的病理过程，以期为温阳振衰颗粒的进一步实验及临床研究提供理论基础。此外，本研究具有一定局限性，如本研究中涉及的成分与靶点可能局限于目前研究的热点，数据库收录数量尚为不足，且涉及的相关机制本身还有待进一步进行研究验证。

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