茵栀黄护肝颗粒制备工艺及质量标准的研究

2021-09-23李小伟栗进才陈云飞张松刘旭东葛君

中国民族民间医药·上半月 2021年9期

李小伟栗进才陈云飞张松刘旭东葛君

【摘要】目的：研究茵栀黄护肝颗粒的制备工艺及质量标准。方法：以成型性、溶化性、吸湿性为指标，通过单因素试验优选茵栀黄护肝颗粒的最佳制备工艺;采用薄层色谱法（TLC）对茵栀黄护肝颗粒中佛手、栀子和黄连进行定性鉴别;运用高效液相色谱仪（HPLC）测定栀子苷含量，流动相乙腈-0.2%磷酸水溶液（10∶90），检测波长238 nm。结果：最佳制备工艺为稠膏∶糊精∶糖粉（1∶0.8∶2.4），干燥温度70 ℃。佛手、栀子和黄连的薄层色谱，斑点清晰且阴性无干扰;栀子苷在0.2052～0.4788 μg（R2=0.9984）浓度范围内呈良好的线性关系，平均回收率99.19% （RSD=0.13%），栀子苷含量不得少于0.45 mg/g。结论：本实验制备工艺可行，建立的质量控制方法专属性强、重复性好，可用于控制茵栀黄护肝颗粒的质量。

【关键词】制备工艺;质量标准;栀子;佛手;黄连

【中图分类号】R282.6 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）17-0047-06

Preparation Process and Quality Analysis of

Yinzhihuang Hugan Granules

LI Xiaowei1 LI Jincai2 CHEN Yunfei1 ZHANG Song1 LIU Xudong1 GE Jun1

1.Mengcheng County Hospital of Chinese Medicine，Mengcheng 233500，China;

2. Bozhou Vocational and Technical College，Bozhou 236800，China

Abstract：Objective To study the preparation process and quality standards of Yin zhihuang Hugan Granules. Methods With formability，solubility and hygroscopicity as indicators，the optimal preparation process of Yin zhihuang Hugan granules was optimized by single factor tests; Thin-layer chromatography （TLC） was used for qualitative identification of gardeniae fructus，fingered citron and coptis chinensis in Yin zhihuang Hugan granules; High Performance Liquid Chromatography （HPLC） was adopted to determine the content of gardenoside with mobile phase of acetonitrile-0.2% phosphoric acid water （10∶90） and detection wavelength of 238 nm. Result The optimal preparation process was thick paste： dextrin： powdered sugar （1∶0.8∶2.4），dryingtemperature at 70 ℃. Spots of gardeniae fructus，fingered citron and coptis chinensis on TLC plates were clear without interference by the blank reference; Gardenoside showed a good linear relationship in the concentration range of 0.2052～0.4788 μg （R2=0.9984），with an average recovery rate of 99.19% （RSD=0.13%），and the content of gardenoside should not less than 0.45 mg·g-1. Conclusion The preparation process of this experiment is feasible，and the quality control method established has strong specificity and good repeatability，which can be used to control the quality of Yin zhihuang Hugan granules.

Keywords：Preparation Process; Quality Standards; Gardeniae Fructus;Fingered Citron; Coptidis Chinensis

茵梔黄护肝颗粒是蒙城县中医院的院内制剂，由垂盆草、半枝莲、白花蛇舌草、虎杖、枳壳、生栀子、茵陈、五味子等药物组成，具有健脾渗湿、疏肝理气、清热解毒、活血养血的功效。经过10多年的临床证明，在慢性乙肝、丙型肝炎、乙肝病毒携带者、肝硬化腹水等病症，疗效确切，未见明显的不良反应。在10多年的临床应用中，是以汤剂为主，将其开发为颗粒剂，既保持了传统汤剂吸收快、显效迅速的优点，又克服了患者服用前需要临时煎煮，费时耗能，久贮易发生霉变、不便于服用、贮存、携带等问题，提高患者用药的依从性。本文通过单因素考察，解决了颗粒剂在制备过程中存在的溶化性、吸湿性、成型性、色泽不均匀等问题，优化出茵栀黄护肝颗粒的制备工艺，并建立其质量控制方法。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器高效液相色谱仪Thermo U3000（美国赛默飞）;SQP（规格：SECURA225D-1CM）型十万分之一电子天平（赛托利斯科学仪器（北京）有限公司）;DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）;JK-500DVE型双频数控超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）;HH数显恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司）;WFH-203三用紫外仪（上海精科实业有限公司）;

1.2 试药茵栀黄护肝颗粒（批号：20190401、20190402、20190403）;栀子苷对照品（批号：110749-201718，中国食品药品检定研究院）;佛手对照药材（120933-201706，中国食品药品检定研究院）;盐酸小檗碱对照品（110713-201814，中国食品药品检定研究院）;色谱乙腈（美国天地）;糊精、蔗糖（均购于曲阜市药用辅料有限公司，批号：20190109F），甲醇、乙腈为色谱纯，水为怡宝纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 茵栀黄护肝颗粒剂的制备按处方量取原料药材，加水煎煮二次，第一次加10倍量水煎煮2 h，第二次加8倍量水煎煮1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.4～1.6（80 ℃）的稠膏，稠膏∶糊精∶糖粉（1∶0.8∶2.4）混匀制软材，制粒（10目筛），干燥（70 ℃），制成1000 g，即得。

2.2 溶化性的测定照中国药典2015版四部规定的可溶性颗粒检查法，取供试品10 g，加热水200 mL，搅拌5 min，立即观察，可溶颗粒在4 min内全部溶化或有轻微浑浊。

2.3 辅料种类的筛选由于本品药材提取所得的稠膏粘性大，无法直接干燥成干膏，因而本制粒工艺采用稠膏加辅料制粒。对于水溶性颗粒剂，目前最常用的辅料为蔗糖粉及糊精。糖粉系蔗糖结晶的细粉，是可溶性颗粒剂的优良赋形剂，并有矫味及粘合作用。糊精系淀粉的水解产物，亦是可溶性颗粒剂的较常用的赋形剂，在传统颗粒剂的生产工艺中，常与糖粉共用作为其辅料。其他尚有乳糖、可溶性淀粉、甘露醇等，但因其来源及价格等因素，在传统颗粒剂生产中，目前使用还不多。另考虑到制粒的吸湿性及成型性问题，故本实验选择稠膏、糊精、糖粉按一定的比例混合制粒。

2.4 輔料配比的考察通过预试验，稠膏与辅料按1∶1比例混合（糊精∶糖粉，1∶1）混合，不易制粒，其成型性较差且易吸湿，本实验选择以下4个比例对辅料比进行考察，记录各比例条件下的结果，其比例见表1。并以制粒情况及颗粒的口感、成型率、溶化性、吸湿率等为综合评价指标，从而筛选出最优的辅料配比。

2.5 颗粒的成型率和溶化性的比较颗粒的成型率根据2015版《中国药典》对颗粒剂粒度的要求，不能通过1号筛与能通过五号筛的总和不得超过15%。因此分别取“2.1”项下制得的颗粒依次过1号筛和5号筛，收集能通过1号筛而不能通过5号筛的颗粒，称重，按“成型率=通过1号筛而不能通过5号筛的颗粒重/样品颗粒重×100%”公式，分别计算4种不同辅料配比下制得的颗粒的成型率。另根据2015版《中国药典》四部中对可溶性颗粒剂溶化性的要求，分别称取4份不同辅料配比下制得的颗粒约10 g，加热水200 mL，搅拌5 min，立即观察颗粒的溶化情况。由结果可知，当稠膏与糊精、糖粉按1∶0.8∶2.4比例混合，制得的软材成型好，易过筛，颗粒粒径合适，收率较高，口感较佳，而且全部溶化。结果如图1、表2。

2.6 吸湿性的考察将底部盛有氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器放入25 ℃恒温箱内恒温96 h，此时干燥器内的相对湿度为75%，分别精密称取4份不同辅料配比下制得的颗粒，约1 g，放入已恒重的称量瓶底部，轻摇使其分布均匀，精密称定，称量瓶盖揭开，置于盛有NaCl过饱和溶液的玻璃干燥器内，于25 ℃恒温箱保存，定时称量，按下式计算吸湿百分率。结果如图2所示。

2.7 制粒工艺条件的验证取3份稠膏，优化的制备工艺，制备3批颗粒剂，以软材及制粒情况、颗粒的成型率及溶化性为指标进行质量检查，考察工艺的稳定性，结果见表3。由表3可知：三份处方所制得的颗粒，从颗粒成型性、收率、溶化性等指标来看，该工艺较为稳定。

2.8 薄层鉴别

2.8.1 栀子[1]

2.8.1.1 对照品溶液的制备称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.8.1.2 供试品溶液的制备称取本品（批号：20190401、20190402、20190403）10 g，研细，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，取滤液置于水浴上蒸干，残渣加无水乙醇1 mL溶解，作为供试品溶液。

2.8.1.3 阴性供试品溶液的制备按处方配比称取除栀子外的其它药材，按茵栀黄护肝颗粒制备方法制成不含栀子的阴性样品，按试品溶液的方法制备阴性样品供试液。

照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述3种溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G板，以三氯甲烷-甲醇（3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰，专属性强，如下图a所示。

2.8.2 佛手[2-3]

2.8.2.1 对照药材溶液制备称取佛手对照药材1 g，加无水乙醇10 mL，超声处理20 min，滤过，取滤液置于水浴上蒸干，残渣加无水乙醇0.5 mL使溶解，作为对照药材溶液。

2.8.2.2 供试品溶液的制备称取本品（批号：20190401、20190402、20190403）40 g，研细，加无水乙醇60 mL，超声处理30 min，滤过，取滤液置于水浴上蒸干，残渣加无水乙醇1 mL溶解，作为供试品溶液。

2.8.2.3 阴性供试品溶液的制备按处方配比称取除佛手外的其它药材，按茵栀黄护肝颗粒制备方法制成不含佛手的阴性样品，按试品溶液的方法制备阴性样品供试液。

照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板，以环己烷-乙酸乙酯（3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置于365 nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰，专属性强，如下图b所示。

2.8.3 黄连[4-5]

2.8.3.1 对照品溶液的制备称取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.8.3.2 供试品溶液的制备称取本品（批号：20190401、20190402、20190403）10 g，研细，加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.8.3.3 阴性供试品溶液的制备按处方配比称取除黄连外的其它药材，按茵栀黄护肝颗粒制备方法制成不含黄连的阴性样品，按试品溶液的方法制备阴性样品供试液。

照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述3种溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G板，以正丁醇-乙酸-水（7∶1∶2）为展开剂，展开，取出;晾干，于365 nm紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰，专属性强，如下图c所示。

2.9 含量测定

2.9.1 对照品溶液的制备取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含34.2 μg的溶液，即得。

2.9.2 供试品溶液的制备[6-7] 取装量差异项下的本品（批号：20190401），研细，取约5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，超声提取20 min，放冷滤过，滤液转至50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，另精密量取10 mL于25 mL容量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，即得。

2.9.3 阴性样品的制备按处方比例及生产工艺制备不含栀子的茵栀黄护肝颗粒，再按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液，即得。

2.9.4 含量测定的色谱条件色谱柱为碳十八烷基硅烷键合硅胶柱;以乙腈-0.2%磷酸（10∶90）为流动相;检测波长为238 nm，进样量为10 μL。理论板数按栀子苷峰计算应不低于1500。见图3所示。

2.9.5 线性关系考察分别精密吸取浓度为0.0342 mg/mL的对照品溶液6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，按上述色谱条件测定。以对照品溶液的进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，得回归方程y=24.8424x+0.3737（R2=0.9984），表明栀子苷在0.2052～0.4788 mg浓度范围内呈良好的线性关系。

2.9.6 精密度考察精密吸取浓度为0.0342 mg/mL的对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下连续测定6次，记录峰面积，栀子峰面积RSD=0.08%，表明仪器精密度良好。

2.9.7 重复性实验取同一批号的本品6份，每份约5 g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，栀子苷含量的RSD=0.37%，表明方法重复性良好。

2.9.8 样品稳定性实验取本品5 g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。分别于配制后0、2、4、8、12 h进样测定峰面积，栀子苷峰面积RSD=0.20%，表明样品在12 h内基本稳定。

2.9.9 加样回收率实验精密称取已知含量的样品6份（每份约2.5 g），精密加入栀子苷对照品适量，按供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表4。

由上表知，样品平均回收率为99.19%，RSD=0.13%。表明方法准确度较高。

2.10 样品测定及含量限度的确定称取茵栀黄护肝颗粒样品3批（批号：20190401、20190402、20190403）适量，精密称定，按照2.9.2供试液制备方法制备供试液，按2.9.4色谱条件测定，测得栀子苷含量分别为0.8511、0.8389、0.8483 mg/g，而《中国药典》2015版一部规定栀子含量（以栀子苷计）应不低于1.5%（15 mg/g）。由处方计算，样品含栀子生药0.06 g/g，故成品理论最低含量为0.9 mg/g。制成制劑后，药材转移率在49.08～51.23%，工艺较为稳定。故成品最低含量范围为0.44～0.46 mg/g。从三批样品并结合生产实际考虑，故本标准栀子苷最低限量暂定为0.45 mg/g。

3 讨论

3.1 剂型的选择茵栀黄护肝颗粒剂是在传统汤剂的基础上，由我院名老中医在经典名方的基础上根据多年临床验证进行加减，经过反复的工艺和剂型的对比研究，选择颗粒剂，既保留了传统汤剂的疗效和特色，又方便于患者服用、携带、贮藏等。

3.2 制备工艺配比的选择通过吸湿性和成型性实验研究发现，在相同温度25 ℃，湿度75%的环境下，不同配比制备的颗粒，成型性和吸湿率差异较大，其中比例三和比例四相差较小，但考虑到实际生产和药物的有效性，最终选择稠膏∶糊精∶糖粉（1∶0.8∶2.4）的配比，颗粒成型性好，吸湿率低，便于颗粒的制备和贮存。

3.3 辅料的选择由于本方采用稠膏加辅料制粒的传统工艺，中药颗粒剂常用的辅料有糊精、乳糖、糖粉等，由于乳糖成本高，价格较为昂贵，不适合大面积推广;糊精能溶于热水，黏合力强;庶糖味甜，黏合力强;结合预实验结果和参考文献，选择稠膏∶糊精∶糖粉（1∶0.8∶2.4）配比制备颗粒。此外，稠膏兼有粘合剂的作用，不需另外加入适量润湿剂或粘合剂，可以省去干燥工艺，节约时间，适用于生产。辅料选用的庶糖兼有矫味剂作用，不需要另外加入矫味剂。结果显示：本方制备的颗粒成型性、吸湿性、溶化性、颗粒的性状、色泽均能满足颗粒剂的评价指标。

3.4 含量测定指标的选择由于茵陈、栀子、垂盆草、均为本方的君药，其中茵陈定量目标成分为绿原酸、滨蒿内酯，通过预实验，绿原酸在专属性实验中，出现干扰，专属性不强;垂盆草含有定量研究成分槲皮素、山奈素、异鼠李素，在研究过程中，专属性不强，半枝莲的研究指标为野黄芩苷，其操作方法与栀子苷相比，方法较复杂，同时，茵栀黄护肝颗粒是采用传统水提取法的制备工艺，可以有效提取栀子中栀子苷含量，转移率高，故选择栀子苷作为茵栀黄护肝颗粒含量测定指标成分，建立含量测定的质量标准，该方法准确可靠、操作简单、更能保证临床用药的安全和有效。

3.5 流动相的选择本实验预实验选择乙腈-水[8-9]、乙腈-0.5%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液[11]、选择乙腈-0.1%磷酸水溶液四种流动相，通过预实验结果峰型和分离度表明，选择乙腈-0.2%磷酸（10∶90）条件下，峰型和分离度良好，明显优于其他流动相效果。

3.6 贮藏条件的选择本制剂是由中药水提物浓缩成稠膏，与辅料混合制备的颗粒剂，由于中药水提物中含糖量较高，所以容易吸湿而产生结块，因此在生产、整粒、包装、贮藏过程中，一定要控制环境温湿度，因此笔者考察在温度为25 ℃，湿度为75%条件下颗粒抗吸湿度，考察结果较好，为颗粒剂的贮藏提供了依据。

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