来源卤化二型聚酮类生物合成基因簇的两种关键功能基因鉴定与表达

王 苗， 岳昌武， 李晓倩， 陈 彬

(1.遵义医科大学 生命科学研究院，贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学 贵州省普通高等学校微生物资源利用及开发特色重点实验室，贵州 遵义 563000；3.延安大学 医学院，陕西 延安 716000；4.遵义医科大学 第三附属医院，贵州 遵义 563000)

卤化物是包括氟化物、氯化物、溴化物、碘化物以及某些卤素互化物的一类有机化合物。大多数卤化物具有重要的生物活性，临床上使用的抗生素和抗肿瘤药物中，有许多来源于微生物的卤化物，如具有抗肿瘤活性的C-1027、蝴蝶霉素以及具有抗菌活性的万古霉素、氯霉素等。2014年批准上市的4个新型抗生素中3个为卤化物，分别为Dalvance、Oritavanci、Sivextro[1-3]。卤化物中的卤素原子对卤化物的生理活性有重要的影响，不仅可以有效提高化合物的相关活性[4-7]，而且可以延长半衰期并增加生物利用度[8-9]。因此，卤化物的发现与研究对新药的开发具有十分重要的意义。卤化物主要来源于微生物，通过传统的纯培养方法挖掘天然卤化物重复率高且不具有定向性[10]。研究表明，卤化物的生物合成基因成簇(Gene cluster)存在于生物的基因组中，其中的卤化酶基因负责化合物的卤化修饰，是能够赋予次生代谢产物活性的一种重要后期修饰酶，具有底物特异性，很可能催化合成新的卤化产物。卤化酶催化的卤化反应在抗生素生物合成途径中起着重要作用，可极大提高代谢产物的生物活性。以卤化酶基因为探针，发现与之偶联的天然生物合成基因簇，利用卤化酶基因序列的保守区域设计简并引物，筛选土壤宏基因组文库获得卤化酶阳性克隆，并对获得的卤化酶基因间的进化及其与天然产物合成的关系进行分析。高鹏等[11]、张继[12]通过对微生物中的卤化酶基因克隆和分析，为卤化物的定向发现提供参考。链霉菌Streptomycessp. FJS31-2基因组全长约11.6 Mb,前期研究发现其产生一系列卤化产物[13-14]，其中包含一个卤化酶II型PKS类产物zunyimycin生物合成基因簇，全长15 462 bp。通过对其生物合成基因簇进行系列分析，发现其中包含后修饰卤化酶基因和单加氧酶基因并构建卤化酶和单加氧酶原核表达载体，进行原核表达纯化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体 链霉菌Streptomycessp. FJS31-2由本实验室(贵州省普通高等学校微生物资源利用及开发特色重点实验室)分离自贵州省梵净山地表10～20 cm土壤样品(海拔高度800 m，东经108°47′50″，北纬27°56′32″)，保存于中国普通菌种保存中心(菌保号：CGMCC 4.7321)。链霉菌Streptomycessp. FXJ1.264由中国科学院微生物所黄英课题组分离自江西瑶里酸性红壤。大肠埃希菌(Escherichiacoli)感受态细胞JM109、BL21(DE3)Rosetta购自博迈德(北京)基因技术有限公司；基因克隆质粒载体pMD18-T simple购自宝生物(大连)公司；表达质粒载体pET-32a 为本实验室保存。

1.1.2 试剂与仪器 高纯质粒提取试剂盒及分子生物学试剂购自博迈德(北京)生物科技公司； rTaq等PCR 反应试剂、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、去磷酸化酶等分子克隆所用酶类购自富酶泰斯(深圳)生物科技公司；培养基、蛋白质表达纯化等生化药品如无特殊说明均购自碧迪医疗(上海)有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒、PCR 产物回收试剂盒等购自爱思进(杭州)生物技术有限科技公司；引物合成及测序由英潍捷基(广州)有限公司完成；IPTG、氨苄青霉素等药物购自西格玛公司；GF254薄层层析(thin layer chromatography，TLC)硅胶板、柱层析用硅胶购自青岛谱科分离材料有限公司；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20购自北京满仓科技有限公司；甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等(均为分析纯)购自成都科龙化工试剂厂；甲醇、乙腈等(均为色谱纯)购自北京迈瑞达公司。紫外分光光度计(BASIC,德国Eppendorf)；高效液相色谱仪(Agilent 1220 Infinity LC VL，美国安捷伦公司)；液质联用仪(1200HPLC/6520 QTOFMS，美国安捷伦公司)；核磁共振仪(AV III，Ascend 500 HD 500 MHz，德国Bruker公司)；英培摇床(DZ-900，太仓市实验设备厂)；旋转蒸发仪(R-210，瑞士步其公司)；培养箱(BSP-400，上海博讯设备仪器厂)；超级洁净工作台(E002092，苏州市金净净化设备科技有限公司)；超纯水机(Direct-Q5UV，美国密理博公司)；超声波提取机(SCIENTZ-15T，宁波新芝公司)；自动蒸汽灭菌器(MLS-3781L-PC，日本松下公司)。

1.1.3 软件 基因组测序结果拼接、核酸比对采用DNAMAN专业软件；序列比对及进化分析[15-17]采用MEGA 5.0专业软件；采用Primer Premier 5专业软件进行引物设计。通过数据库专业网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行核酸及蛋白序列的比对和分析、基因序列的上传[18]，通过数据库专业网站antiSMASH(http://antismash.secondarymetabolites.org/)进行次级代谢基因簇分析[19]。

1.2 方法

利用DNA重组技术，将本实验室克隆并鉴定的卤化二型聚酮化合物zunyimycins生物合成基因簇的后修饰基因单独与表达质粒载体pET32a重组，构建重组原核表达质粒载体，并转化大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3)和Rosetta获得基因工程菌，利用卤化酶和单加氧酶体外组合催化zunyimycins非卤化前体物Anthrabenzoxocinones(ABX, BE-24566B)，分析其卤化催化机制。

1.2.1 系统进化分析 将基因组分析得到的氨基酸残基序列，经BLAST在线比对，NCBI数据库中BLAST程序在线进行氨基酸序列相似性比对搜索，从GenBank数据库中获得相似性较高且为有效描述的典型菌株的氨基酸序列作为参比对象，采用MEGA 5.0软件进行聚类分析并构建NJ系统发育树。

1.2.2 目的基因克隆及原核表达质粒载体构建 利用primer5.0 等生物软件， 根据本实验室前期链霉菌Streptomycessp. FJS31-2基因组测序结果，设计编码基因的完全编码区扩增引物，Halo编码基因上下游引物分别加入限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ识别位点，Mono编码基因上下游引物分别加入限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ识别位点。HaloEF/ER卤化酶特异引物和mOXYEF/ER单氧酶特异引物以Streptomycessp. FJS31-2基因组DNA为模板扩增、PCR产物纯化、TA克隆、特异引物PCR验证、测序验证阳性克隆、菌株Halo-T采用限制性酶BglⅡ和HindⅢ双酶切，菌株Mono-T采用限制性酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切，双酶切片段分别连接相应酶切并去磷酸化处理的表达载体pET-32a，室温反应6 h，转化JM109感受态细胞，用特异引物进行菌液PCR鉴定及质粒酶切鉴定，测序鉴定，经测序验证后的原核表达质粒载体分别命名为pET-halo和pET-mono。

1.2.3 目的蛋白诱导表达 分别取阳性克隆菌pET-halo、pET-mono质粒和pET32a 质粒100 ng，转化大肠埃希菌BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，转化子培养过夜、T7 启动子引物菌液PCR 鉴定后，将含重组质粒的基因工程菌分别命名为pET-haloBL21、pET-monoBL21和pET32aBL21。取这3种基因工程菌各50 μL，分别接种于5 mL 含终浓度100 ng/μL 氨苄西林的LB 液体培养基中，220 r/min，37 ℃培养3 h进行活化，然后分别接种100 mL 含终浓度100 ng/μL氨苄西林的LB 液体培养基中，220 r/min、37 ℃ 培养至OD600=0.3 时，分别取5 mL液体培养物分装至50 mL 无菌离心管，加入终浓度1.0 mmol/L 的IPTG，28 ℃恒温摇床诱导6 h。取1 mL 诱导后培养物，4 000 r/min 离心5 min，菌体沉淀加入100 μL 5×SDS-PAGE 电泳上样缓冲液，99 ℃金属浴裂解10 min，12 000 r/min，室温离心10 min，上清即为菌体总蛋白裂解液。分别取10 μL 总蛋白裂解液上样，10%SDS-PAGE凝胶电泳。考马斯亮蓝R250 染色6 h 后，甲醇-冰醋酸脱色液脱色6 h，判断蛋白质表达情况。

2 结果与分析

2.1 关键基因系统进化分析

链霉菌Streptomycessp. FJS31-2中单加氧酶蛋白序列AbxO与糖多孢菌属Saccharomonosporasp.xinjiangensis的氨基酸序列同源性为33%、Saccharomonosporasp.CNQ490的氨基酸序列同源性为31%、Saccharomonosporasp.cyanea NA-134的氨基酸序列同源性为32%、Saccharomonosporasp.glauca的氨基酸序列同源性为31%，与链霉菌属Streptomycessp.violaceusniger的氨基酸序列同源性为31%、与Streptomycessp.iranensis的氨基酸序列同源性为33%、与Streptomycessp.PRh5的氨基酸序列同源性为33%，与Streptomycessp.violaceusniger TU4113的氨基酸序列同源性为31%(图1)。

链霉菌Streptomycessp. FJS31-2AbxH卤化酶蛋白序列与链霉菌属Streptomycessp.prunicolor的卤化酶氨基酸序列同源性为57%、与Streptomycessp.iranensis的同源性为53%、与Streptomycessp.roseochromogenus的同源性为47%、与Streptomycessp.scopuliridis的同源性为46%，与盐孢菌属的两株不同菌的同源性都均54%，与小单孢菌属Micromonosporaechinospora的卤化酶蛋白序列同源性为53%，与拟无枝酸菌属Amycolatopsisrifamycinica的卤化酶氨基酸序列同源性为58%、与Amycolatopsissp.decaplanina DSM44594的同源性为53%，与一株未分类细菌的卤化酶氨基酸序列同源性为56%(图2)。

图1 链霉菌Streptomyces sp. FJS31-2 AbxO与其他菌株Monooxygenase基因系统进化分析Fig.1 Analysis of the gene system evolution of Streptomyces sp. FJS31-2 AbxO and other strains of Monooxygenase◇:已鉴定功能产生单加氧酶的SchA蛋白; ▲:链霉菌Streptomyces sp. FJS31-2 AbxO蛋白◇：the SchA protein whose function has been identified to produce monooxygenase；▲：Streptomyces sp. FJS31-2 AbxO protein

图2 链霉菌Streptomyces sp. FJS31-2 AbxH与其他菌株Halo基因系统进化分析Fig.2 Analysis of the gene system evolution of Streptomyces sp. FJS31-2 AbxH and other strains of Halo◇:已鉴定功能的卤化酶蛋白CalO3; ▲:链霉菌Streptomyces sp. FJS31-2 AbxH蛋白◇：the halogenase protein CalO3 with identified function; ▲：Streptomyces sp. FJS31-2 AbxH protein

2.2 pET-abxH和pET-abxO表达载体构建

以链霉菌Streptomycessp.FJS31-2基因组为模板，特异引物扩增abxH和abxO目的片段，分别TA克隆，T载体通用引物M13F/M13R进行菌液PCR鉴定，abxH/T质粒BglⅡ和HindⅢ限制性内切酶酶切鉴定并胶回收1 300 bp目的片段，连接相同酶切并去磷酸化处理的质粒载体pET32a，abxO/T质粒酶HindⅢ和XhoⅠ酶切鉴定并胶回收753 bp目的片段，连接相同酶切并去磷酸化处理的质粒载体pET32a，两种连接产物室温过夜连接，转化克隆菌株JM109感受态细胞。分别命名为pET-abxH-J和pET-abxO-J。

pET-abxH-J进行特异引物菌液PCR鉴定，扩增出对应的目的条带1 300 bp(图3)；pET-abxO-J进行特异引物菌液PCR鉴定，扩增出对应的目的条带753 bp(图4)。扩增出目的条带的阳性克隆提取质粒限制性内切酶酶切鉴定，pET-abxH-J质粒BglⅡ和HindⅢ限制性内切酶双酶切鉴定，可以切出载体片段5 900 bp和插入的目的条带1 300 bp，pET-abxO-J质粒HindⅢ和XhoⅠ限制性内切酶双酶切鉴定，可以切出载体片段5 900 bp和插入的目的条带750 bp，鉴定的阳性克隆测序验证。

图3 pET-abxH-J连接转化JM109感受态细胞特异引物鉴定Fig.3 pET-abxH-J identification of specific primers for connecting transformed JM109 competent cells1～20: 随机挑选转化子;M: 2 000 bp DNA Marker1-20: randomly selected transformants; M: 2 000 bp DNA Marker

图4 pET-abxO-J连接转化JM109感受态细胞特异引物鉴定Fig.4 pET-abxO-J identification of specific primers for connecting transformed JM109 competent cells1～24:随机挑选转化子;M:2 000 bp DNA Marker1-24: randomly selected transformants; M: 2 000 bp DNA Marker

2.3 目的蛋白诱导表达

测序验证的阳性菌转化表达菌株BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，特异引物菌液PCR鉴定(图5、6)，分别命名为pET-abxH-R、pET-abxO-R，并进行诱导表达，蛋白样品处理，SDS-PAGE蛋白质电泳分析，可见明显的诱导蛋白条带(图7)，卤化酶分子量大小为65 kD，单加氧酶分子量大小为37 kD。

图5 pET-abxH-J连接转化BL21(DE3)Rosetta感受态细胞特异引物鉴定Fig.5 pET-abxH-J identification of specific primers for connecting transformed BL21(DE3)Rosetta competent cells1～22: 随机挑选转化子；M: 2 000 bp DNA Marker1-22: randomly selected transformants； M: 2 000 bp DNA Marker

图6 pET-abxO-J连接转化BL21(DE3)Rosetta感受态细胞特异引物鉴定Fig.6 pET-abxO-J identification of specific primers for connecting transformed BL21(DE3)Rosetta competent cells1～3: 随机挑选转化子；M: 2 000 bp DNA Marker1-3:randomly selected transformants； M:2 000 bp DNA Marker

图7 pET-abxH-R(A)、pET-abxO-R(B)诱导表达蛋白质电泳分析Fig.7 pET-abxH-R(A)，pET-abxO-R(B) induced expression protein electrophoresis analysisA：pET-abxH-R SDS-PAGE电泳图， BSA:牛血清蛋白，分子量为66 kD，与卤化酶大小相似，作为对照；1：诱导菌株蛋白表达；2：未诱导菌株蛋白表达；M：蛋白质Marker。B：pET-abxO-R SDS-PAGE电泳图, 1：诱导菌株蛋白表达；2：未诱导菌株蛋白表达；M：蛋白质MarkerA: pET-abxH-R SDS-PAGE electrophoresis chart, BSA: bovine serum protein with a molecular weight of 66 kD, which is similar to the size of halogenase, which is a control; 1： the protein expression of the induced expression strain; 2: the protein expression of the uninduced strain; M: Protein Marker.B: pET-abxO-R SDS-PAGE electrophoresis chart, 1: the protein expression of the induced expression strain; 2: the protein expression of the uninduced strain; M: the protein Marker

3 讨 论

重组质粒pET-abxH 和pET-abxO 转化大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，分别以不同的诱导温度诱导表达目的蛋白，SDS-PAGE蛋白质电泳分析，诱导的两种蛋白可溶性表达。后续采用Ni-NTA亲和层析进行浓缩、提取，纯化目的蛋白，催化通过正向硅胶柱纯化链霉菌Streptomycessp. FXJ1.264发酵产物中的二型聚酮骨架化合物BE-24566B，在其骨架上插入卤化基团，得到了疑似卤化产物峰图，但是由于催化的不稳定性及产物不唯一性，这个实验目前还在优化中，希望找到最优的催化时间及催化缓冲液，得到一系列卤化产物，对其结构进行解析，并分析活性，得到一种或几种活性较好的卤化产物，为抗生素的来源提供参考。

卤族元素具有强大的电负性，使得卤化物具有良好的、多样的生物活性。目前，卤化物已经在生命科学和化工生产中占据着不可替代的位置。截止目前，天然卤化物的数量已超过5 000种[20]，这些卤化物主要由微生物、海绵、高等植物和昆虫等几种生物产生，其中约95%的卤化物为氯化物和溴化物。在全球销售的药品中，25%的化合物具有卤原子[21]。一些众所周知的药物如氯霉素(chloroamphenicol)、万古霉素(vancomycin)、替考拉宁(teicoplanin)、卡利奇霉素(calicheamicin)和蝴蝶霉素(rebeccamycin)等药物在临床上普遍应用。此外在洗涤剂、杀虫剂等化工品种中，卤化物也占有很大比重。卤化物的潜在生物活性与结构多样性引起了研究者越来越广泛的关注[22-25]。

随着基因组学、分子生物学等学科领域的快速发展，通过基因筛选发掘放线菌活性天然产物成为可能。已有研究表明，放线菌次级代谢产物的合成途径中包含一些关键酶，分别用于合成不同类型的化合物骨架和进行不同的后期修饰，使其最终成为特定结构类型的活性化合物，而且其合成途径中的相关基因均成簇排列，比如在放线菌基因组中，排列在约20～200 kb范围内。因此编码这些关键酶的基因可以作为筛选靶点，探究菌株合成某类次级代谢产物的能力，并获得相应的次级代谢产物。这一技术手段已经被用于聚酮(Polyketide)类和非核糖体肽 (Nonribosomal peptide)类化合物及其基因簇的筛选。基于PKS和NRPS基因筛选限定了目的化合物的结构类型，不利于广泛筛选未知化合物，而且通过PKS和NRPS途径合成的化合物往往需要经过后期修饰酶的结构修饰，如环化、氧化、卤化、内酯化、甲基化、糖基化等，才能最终产生有活性的化合物。因此，后修饰酶基因筛选更有助于发现结构多样的活性化合物[26]。