药用石斛内源褪黑素含量及动态水平变化的研究

肖学宸 ，王培育 ，叶 炜 ，陈 燕 ，苏立遥 ，许旭明 ，赖钟雄 ，林玉玲 *

（1.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州 350002；2.三明农业科学研究院，福建沙县 365000）

褪黑素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺）是在植物和动物体内发现的一种重要的吲哚胺激素[1]。大量的研究证明了褪黑素增强人体免疫系统和抵抗癌症的能力[2-5]。迄今为止，研究人员在番茄[6]、辣椒[7]、甜樱桃[8]和桑叶[9]等植物中均检测出褪黑素的存在。Galano 等[10]发现褪黑素可以渗透到任何植物组织，并作为抗氧化剂清除组织中的活性氧和活性氮。Debnath 等[11]发现褪黑素也是一种化学传递信号，通过提高其他抗氧化剂效率的方式，在植物受到胁迫时为正常的植物生长提供保护。同时，外源褪黑素的施加通过影响糖尿素-萝卜硫素系统[12]、保护细胞膜完整性[13]、提高抗氧化物质活性[14]和减轻褐变[15]等方式，对食品的采后保鲜产生一定的积极作用，这意味着褪黑素在植物代谢过程中扮演着重要角色。

药用石斛是兼具观花功能的药草，它的不同种和品种在全球各地的鲜花市场中占据了超过20%的销售份额[16]。在传统中药中，药用石斛是免疫力增强剂[17]，还具有降低血糖[18]和保护肝脏[19]的作用。经过研究发现，金钗石斛、鼓槌石斛和霍山石斛的多糖和菲类化合物提取物具有抗癌作用[17，20]。罗傲霜等[21]和张勇等[22]发现迭鞘石斛和铁皮石斛也具有提高免疫力和抗癌的作用。Liu 等[23]的最新研究同样表明了药用石斛具有改善动物免疫力的作用。同时，Moretti 等[24]将药用石斛抵抗衰老的功效归因于它具有抗氧化的特性。因此，褪黑素在药用石斛中可能存在并在药用石斛的药效中发挥了直接或间接的作用。Lim 等[25]发现外源褪黑素会导致石斛原球茎中出现不规则的细胞谱系，但截至目前，药用石斛的内源褪黑素动态水平变化还未见报道。

因此，该研究拟借助8 种具有高药效的药用石斛，探讨种、植株年龄、组织成熟度、植株部位和昼夜变化对药用石斛内源褪黑素含量的影响，以期为药用石斛中有效成分的进一步开发和研究褪黑素的作用机理提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料。试验选择不同年龄且具有高药用价值的流苏石斛（Dendrobium fimbriatumHook，V1）、迭鞘石斛（Dendrobium denneanumKerr，V2）、紫皮石斛（Dendrobium devoninumPaxt，V3）、金钗石斛（Dendrobium nobileLindl，V4）、鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxumLindl，V5）、剑叶石斛 （Dendrobium acinaciformeRoxb，V6）、铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo，V7） 和霍山石斛（Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng，V8），表型如图1 所示。

1.1.2 试验试剂。ELISA 检测试剂；磷酸缓冲液（购于上海江莱公司）。

1.1.3 试验条件。8 种药用石斛都在大棚中具有相同比例的干燥椰子壳基质的塑料盆中正常生长，外观如图1所示。根据不同种的特性，每个盆中的药用石斛数量为5~20。1 周浇水2 次，采摘过程中温室温度在8℃~28℃之间，温室中的湿度为60%~80%。采摘之后的试验在三明农业科学研究院的实验室进行，使用的仪器在2 年内购买且没有损坏，实验室温度保持在25℃。

图1 流苏石斛（V1）、迭鞘石斛（V2）、紫皮石斛（V3）、金钗石斛（V4）、鼓槌石斛（V5）、剑叶石斛（V6）、铁皮石斛（V7）和霍山石斛（V8）的表型

1.2 方法

1.2.1 样品采集。样品采摘时间为2020 年1 月1—3 日，采摘后立即用液氮冷冻并于-60℃保存。为了确保样品的代表性，每盆石斛中仅选择一株生长适中且无病害的植株，3 株为一组，将测定的相同组织部位切碎并混合均匀，进行褪黑素的提取。设置3 次生物学重复，分别提取，提取后立即进行褪黑素含量检测。

1.2.2 褪黑素含量测定。使用植物褪黑素ELISA 检测试剂盒（上海江莱公司）检测药用石斛的褪黑素含量。根据具体情况，按说明书比例增加了称取的样品质量和磷酸盐缓冲溶液。

（1）提取：称取切碎混匀的植株部位0.2 g，添加1.8 mL预冷的磷酸盐缓冲溶液，在冰浴条件下将其研磨成匀浆。离心（5 000 g，8 min）得到匀浆并收集上清液。3 次生物学重复得到的上清液混合。

（2）测定：在96 孔酶标板的孔中加入50 μL 提取得到的上清液或标准浓度的褪黑素溶液（空白对照为添加50 μL 样品稀释液）。加入100 μL 辣根过氧化物酶溶液，在用膜密封孔的条件下于37℃孵育1 h。取出酶标板，弃去孔中的液体，加入20 倍稀释的洗涤溶液，静置1 min。弃去液体后，在吸水纸上轻轻拍打酶标板。再次添加洗涤液进行洗涤，总共重复洗涤步骤5 次。清洗后，依次加入TMB 底物溶液A 和B 50 μL，并立即在37℃的条件下黑暗孵育15 min。最后取出酶标板，添加50 μL 终止溶液终止反应，并用酶标仪测量样品的吸收光密度（波长450 nm），通过与标准曲线（图2）比较，最终获得褪黑素的浓度。设技术重复3 次。

图2 褪黑素浓度和吸光度标准曲线

1.2.3 数据分析。褪黑素浓度表示为平均值±SD，并且通过Duncan’s 检验，检测测定值是否存在统计学显著差异（0.05 为显著性水平）。统计分析在SPSS 软件上进行。

2 结果与分析

2.1 种间因素对褪黑素含量的影响分析

为探究种间因素对褪黑素含量的影响，以8 种主要药用石斛一年生成熟茎（P4）为原材料，其褪黑素含量在27.19~89.81 pg/g 区间波动（图3）。褪黑素含量最低的是铁皮石斛（V7，27.19±5.81 pg/g，f.w.），最高是金钗石斛（V4，89.81±1.60 pg/g，f.w.），金钗石斛（V4）的褪黑素含量比铁皮石斛（V7）高 230%。同时，Duncan’s 检验将 8 种药用石斛一年生成熟茎（P4）的褪黑素含量分成了5 个差异显著的子集并呈现出阶梯状（P≤0.05）。这说明种间差异是影响药用石斛褪黑素含量的重要因素。

图3 不同种药用石斛一年生成熟茎（P4）的褪黑素含量

2.2 药用石斛褪黑素含量的昼夜变化分析

为探究药用石斛褪黑素含量的昼夜变化，选择多种药用石斛不同部位测定褪黑素含量。在迭鞘石斛（V2）中，一年生顶叶的褪黑素含量随着时间的变化呈现阶段性变化，且在相邻时间点之间呈现明显的升高和降低趋势，最低点为：11：00 am（40.66±0.85 pg/g，f.w.），然后逐渐上升并达到最高点：11：00 pm（48.70±0.36 pg/g，f.w.），之后呈下降趋势（图5）。这表明黑暗可能会诱导褪黑素合成，或间接影响褪黑素含量。

图4 迭鞘石斛（V2）一年生顶叶（P1）褪黑素含量的日变化

图5 铁皮石斛（V7）一年生顶叶（P1）11：00 am 至 11：00 pm的褪黑素含量变化

在铁皮石斛 （V7） 的一年生顶叶 （P1，49.04±1.79-52.20±1.70 pg/g，f.w.）中出现了相同的褪黑素含量昼低夜高的现象（图6）。同样，在流苏石斛（V1）中，一年生顶叶（P1，55.12±0.48-58.40±0.58 pg/g，f.w.）和一年生成熟茎（P4，53.13±0.28-54.49±0.59 pg/g，f.w.）的褪黑素含量随着夜晚的到来显著增加 （P≤0.05）；一年生成熟叶（P3）和二年生成熟茎（P6）的褪黑素含量虽然有增加但并不显著（P>0.05）（图7）。初步分析，出现这种现象的原因可能和褪黑素的功能有关。

图6 流苏石斛（V1）不同部位于11：00 am 和11：00 pm的褪黑素含量对比

3 讨论

3.1 种间差异是影响药用石斛褪黑素含量的最主要因素

褪黑素在药用石斛各组织部位的广泛存在表明它可能在药用石斛的药效中扮演着重要的角色。研究人员在测定樱桃[26]、番茄[6]、桑叶[9]、草莓[27]和辣椒[7]的褪黑素含量时，将种视为影响褪黑素含量的最主要因素。相较于苹果（47.6 pg/g）[28]，樱桃（12.4 pg/g）[26]，土豆（10 pg/g）[27]和香蕉（1.6 pg/g）[27]等果蔬，药用石斛的褪黑素含量处于较高水平。但是，红番茄（0.64~14.77 ng/g）[7]，黑芥菜籽（129 ng/g）[29]和桑叶（1 510 ng/g）[30]等果蔬的褪黑素含量高于药用石斛。与其他物种相比，药用石斛的褪黑素含量并不处于很高水平，但依然超过了许多日常食用的果蔬，同时，这表明褪黑素可能在药用石斛的抵抗衰老、提高免疫力和抗癌功效中起更多间接作用，如Debnath 等[11]所述，褪黑素可以通过增加其他抗氧化剂的活性来发挥作用。在上述一些报告中，有研究分析称测量方法也是影响样品中褪黑素含量的一个重要因素。但总而言之，在相同测定方法的条件下，检测出不同种药用石斛之间的褪黑素含量存在巨大差异，这表明种可作为选择高褪黑素含量的药用石斛的一个标准。

3.2 药用石斛褪黑素含量的规律性波动可能为昼低夜高

Zhao 等[8]在甜樱桃果实中观测到了褪黑素含量在夜间升高的现象，此现象说明了光是内源褪黑素含量的影响因素之一，黑暗可能能诱导褪黑素的合成。Morteza Soleimani Aghdam 等[13]证明褪黑素可以促进内源性多胺、一氧化氮和脯氨酸的积累，从而提高番茄的耐寒性。在这项试验中，3 种药用石斛的褪黑素含量出现了相同的昼低夜高现象，除了光因素的影响，昼夜温差也可能是造成此现象的原因。

在石斛中，年幼组织生长发育和茎上开花需要消耗和积累大量的能量物质[31-32]。能量物质的高消耗水平意味着高强度的呼吸作用。Zhao 等[8]的研究表明，氧化应激诱导褪黑素合成。同时，最近的一项报道显示，褪黑素可以作为一种有效的抗氧化剂提高鲜切花西兰花中的葡萄糖尿素和萝卜硫素含量[12]。褪黑素还可以在降低采后樱桃的H2O2含量方面发挥积极作用[14]。在收获时期，顶叶的生长和茎的开花过程都处于进行状态，在没有光合作用的情况下，处于代谢较旺盛时期的一年生顶叶和成熟茎在夜间进行较高水平的能量代谢后，提升更高的褪黑素含量可能有助于清除氧化性自由基。