GSH对铅胁迫下多年生黑麦草生长及光合生理的影响

2021-09-22赵利清彭向永刘俊祥毛金梅孙振元

草业学报 2021年9期

赵利清，彭向永，刘俊祥，毛金梅，孙振元*

（1.国家林业和草原局林木培育重点实验室，中国林业科学研究院林业研究所，北京100091；2.国家开放大学，北京100039；3.曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜273165；4.新疆林业科学院经济林研究所，新疆乌鲁木齐830063）

铅（Pb）与汞（Hg）、镉（Cd）、铬（Cr）、砷（As）并称“五毒”重金属，广泛分布于环境之中［1－2］。Pb可以通过植物根系的Ca2+通道或叶表皮的角质层小孔、气孔器和排水器等进入植物体内，Pb在植物体内不能被降解［3－4］，累积的Pb会对植物产生毒害，如膜脂过氧化、酶失活、干扰矿质元素吸收及抑制光合作用等［5－8］。光合作用是环境胁迫最为敏感的生理过程［9］，Pb胁迫能够使植物气孔关闭、叶绿体结构受损、卡尔文循环中的酶失活、光合色素合成和电子传递受阻等，最终抑制植物生长或导致死亡［10］。因此亟待找到一种缓解Pb毒害的方法。

由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的活性三肽－谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH），在重金属解毒方面发挥了重要的作用。研究发现过表达枸杞谷胱甘肽合成酶基因（LcGS）的烟草（Nicotiana tabacum），在Cd胁迫下，GSH、植物螯合肽（phytochelatins，PCs）和叶绿素含量明显高于对照，对镉的抗性显著增加［11］。外源GSH能够增加植物的内源GSH含量，降低活性氧（reactive oxide species，ROS）含量，使抗氧化酶活性和细胞膜的稳定性增加，植物对Zn、Cd和Gu的耐受性增强［12－18］。相反，谷胱甘肽合成酶抑制剂丁硫氨酸－亚砜亚胺（L-Buthioninesulfoximine，BSO）能够抑制谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性，使植物体内GSH和PCs含量减少，抗性降低［19－20］。目前，对GSH缓解植物重金胁迫的研究主要集中在Cd胁迫下抗氧化酶活性和细胞膜稳定性等方面，对Pb胁迫下光合作用的研究至今未见报道。

本研究以多年生黑麦草（Lolium perenne）为材料，设定CK、Pb、Pb+GSH和Pb+BSO 4个处理，测定生长指标、光合色素含量、光合参数和叶绿素荧光动力学参数，研究GSH对Pb胁迫下多年生黑麦草生长及光合作用的影响，以探讨GSH对Pb毒害的缓解效果和生理机制，为进一步阐明GSH解毒重金属胁迫机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 幼苗的培养

多年生黑麦草种子购自京东网“芳之葵”农资专营店，品种为‘卡特’（L.perenne‘cuttle’）。2018年5月将种子均匀地撒播于装满营养土的花盆中，常规养护管理。培养6周后，选生长一致的植株，洗净根部泥土，定置于盛有9 L 1/2 Hoagland营养液的培养盆中继续培养6周，营养液pH调为6.0，每盆3株，期间每周更换一次营养液并利用充气泵连续充气。

1.2 试验处理

通过前期试验筛选Pb处理浓度，用0、0.50、0.75、1.00、1.50 mmol·L－1Pb（NO3）2根部处理12周大幼苗，处理1周。选择膜透性、可溶性蛋白和生长高度出现显著差异的最低浓度0.75 mmol·L－1作为处理浓度。并且根据文献［21－22］确定GSH和BSO的处理浓度。

试验共设CK、Pb、Pb+GSH和Pb+BSO 4个处理，每个处理3次重复。Pb（NO3）2直接加入营养液中，为避免Pb2+与营养液中的H2PO4－反应产生沉淀降低Pb效应，处理营养液采用无KH2PO4的1/2 Hoagland营养液，通过每盆喷施1次20 mL的0.2%的KH2PO4溶液补充磷和钾元素。GSH和BSO采用叶面喷施法，喷施蒸馏水、GSH和BSO间隔0.5 h，待前者充分吸收后，再喷施后者。每天上午喷施1次，连续处理1周，处理期间利用充气泵持续充气。具体如下：CK）：1/2 Hoagland营养液，喷50 mL蒸馏水；Pb）：含0.75 mmol·L－1Pb（NO3）2的1/2 Hoagland营养液，喷50 mL蒸馏水；Pb+GSH）：含0.75 mmol·L－1Pb（NO3）2的1/2 Hoagland营养液，先喷25 mL蒸馏水，再喷施25 mL 10 mmol·L－1GSH；Pb+BSO）：含0.75 mmol·L－1Pb（NO3）2的1/2 Hoagland营养液，先喷25 mL蒸馏水，再喷施25 mL 1 mmol·L－1BSO。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 茎叶、根长和分蘖数的测定茎叶和根长：用刻度尺测量每一单株中最长的茎叶和根，测定3株，取平均值，精确到0.1 cm。分蘖数：以每穴（包括主茎）全部分蘖来统计多年生黑麦草的分蘖数［23］。

1.3.2 生物量的测定用自来水冲洗植株去除表面粘附物，然后用10 mmol·L－1Na2-EDTA浸泡吸附根系表面附着的Pb2+，再用去离子水洗净，吸干水分，称鲜重后于105℃杀青30 min，75℃下烘干至恒重，称干重［24］，以每穴为单位分别计算多年生黑麦草茎叶和根的生物量。根冠比=根干重/茎叶干重。

1.3.3 光合色素含量的测定取多年生黑麦草成熟叶片0.25 g，80%丙酮提取，用分光光度计测定663、645和470 nm波长的吸光值［24］，并以Arnon（1949）法计算叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量。

1.3.4 光合参数的测定选生长良好的成熟叶片，于上午9：00－11：00用CIRAS-2型便携式光合仪（英国）测定多年生黑麦草的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）及蒸腾速率（Tr）。试验中所用光源为白炽灯，叶室温度自动调控，供气气体流速200 mL·min－1，大气CO2浓度450 μmol·mol－1，自动记录，间隔时间3 s。

1.3.5 叶绿素荧光动力学参数的测定植株在暗室中适应30 min后，用Handy PEA（Plant Efficiency Analyser；Hansatech Instrument Ltd.，UK）测定叶绿素荧光动力学参数，测定光源为650 nm的红光，光照强度为2500 μmol·m－2·s－1的饱和光强，荧光信号的记录时程为2 s，解析从叶绿素荧光动力学曲线中得到的主要荧光参数，每个重复测定3次。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0进行数据的统计分析，最小显著性差异法（least significant difference，LSD）检验P＜0.05水平上的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 GSH对Pb胁迫下多年生黑麦草茎叶长、根长及分蘖的影响

与对照组比较，Pb处理下多年生黑麦草茎叶长、根长和分蘖数分别显著降低了36.7%、41.9%和37.3%（P＜0.05）。Pb+GSH处理下，茎叶长、根长和分蘖数较Pb处理组均显著增加，但仍然显著低于对照。与Pb处理组比较，Pb+BSO处理下，茎叶长略微增加，根长和分蘖数稍有下降，但均无显著差异（图1）。

图1 外源GSH和BSO诱导Pb胁迫下多年生黑麦草的茎叶长、根长及分蘖数Fig.1 Shoot length，root length and tiller number of perennial ryegrass induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.2 GSH对Pb胁迫下多年生黑麦草生物量的影响

与对照组比较，Pb处理下多年生黑麦草茎叶鲜重、干重、根的鲜重和干重及根冠比分别显著降低了52.1%、37.9%、65.7%、41.7%和7.3%（P＜0.05）。Pb+GSH处理下，较Pb处理组的茎叶鲜重、干重和根的鲜重、干重以及根冠比均显著提高，但除了根冠比之外，其他指标仍显著低于对照组。Pb+BSO处理较Pb处理组，茎叶鲜重和干重以及根干重均显著下降，但根冠比显著升高。这表明Pb胁迫抑制了植物的生长，而且对根的抑制大于茎叶，喷施GSH能够缓解Pb对多年生黑麦草生长的抑制作用，BSO则加剧了Pb的抑制作用（表1）。

表1 外源GSH和BSO诱导Pb胁迫下多年生黑麦草的生物量及根冠比Table 1 Plant biomass and root-shoot ratio of perennial ryegrass induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.3 GSH对Pb胁迫下多年生黑麦草光合色素的影响

Pb处理下，多年生黑麦草叶片叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量较对照分别下降了8.6%、12.2%和9.6%，均达到了显著水平（P＜0.05）。Pb+GSH处理较Pb处理组，叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均显著增加。Pb+BSO处理下，类胡萝卜素的含量显著低于Pb处理组（表2）。

表2 外源GSH和BSO诱导Pb胁迫下多年生黑麦草的叶片光合色素含量Table 2 Photosynthetic pigment content of perennial ryegrass leaf induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.4 GSH对Pb胁迫下多年生黑麦草光合参数的影响

Pb、GSH和BSO处理下多年生黑麦草叶片光合参数发生了不同的变化，单一Pb处理下，净光合速率、蒸腾速率、气孔导度比对照分别显著降低了64.3%、51.5%和67.0%，胞间二氧化碳浓度显著增加了5.2%（P＜0.05）。Pb+GSH处理下，较Pb处理组，净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度均显著增加。Pb+BSO处理下，较Pb处理组，净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度均呈现下降趋势。这表明Pb胁迫抑制了多年生黑麦草的光合作用，外源GSH可缓解Pb胁迫作用，而BSO具有与GSH相反的功能（表3）。

表3 外源GSH和BSO诱导Pb胁迫下多年生黑麦草的叶片光合参数Table 3 Photosynthetic parameters of perennial ryegrass leaf induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.5 GSH对Pb胁迫下多年生黑麦草叶绿素荧光动力学参数的影响

单一Pb胁迫下，Fo、Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo和PIABS较对照组均显著降低（P＜0.05），下降幅度最大的是PIABS，达到35.98%，最小的是Fv/Fm，只有1.93%，这表明Pb对植物的整体性能影响最大。Pb+GSH处理下，各项指标较Pb处理都有所增加，增幅最大的是PIABS，为26.1%。Pb+BSO处理下，与Pb处理组相比，各项指标变化趋势不统一，但均没有显著差异（表4）。

表4 外源GSH和BSO诱导Pb胁迫下多年生黑麦草的叶绿素荧光动力学参数Table 4 Chlorophyll fluorescence kinetic parameters of perennial ryegrass leaf induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

3 讨论

植物的生长状态可以直接反映出受胁迫的程度，因此是评估抗逆性的重要指标［25］。前人研究表明，Pb胁迫下植物株高和生物量降低，分蘖数减少，生长受到抑制［7，26－27］。同样，Pb胁迫下多年生黑麦草的茎叶长、根长、分蘖数和生物量均显著降低，喷施GSH后，茎叶长、根长、分蘖数和生物量都显著增加，这可能是GSH调节光合作用，诱导生长素合成酶基因的表达，保证了部分细胞正常分裂，缓解Pb胁迫对幼苗生长的抑制［16，28］。相反，Pb胁迫下多年生黑麦草喷施BSO后，根长、分蘖数和生物量都呈下降趋势，生长受到严重的抑制，这与在东南景天（Sedum alfredii）上的研究结果相符［29］。

叶绿素负责光能的吸收、传递和转换，是植物进行光合作用的物质基础［30］。重金属离子能够取代植物叶绿体蛋白质中的Fe2+、Zn2+、Mg2+或与功能基团－SH结合，致使叶绿体蛋白中心离子组成发生改变而失活，导致叶绿素含量和光合能力下降［31］，本研究与前人报道一致，Pb处理下多年生黑麦草叶绿素含量显著降低。外源GSH能够增加Cd、Cu胁迫下水稻（Oryza sativa）和海洲香薷（Elsholtzia haichowensis）的叶绿素含量［15，32］，本研究中GSH处理后，多年生黑麦草叶绿素含量显著增加，可能是由于外源GSH降低了Pb与SH结合或对叶绿素中心离子的取代，保护了光合电子链中酶的活性，从而保证了叶绿素的合成。

类胡萝卜素除了具有吸收和传递光能功能外，还可以猝灭激发态的叶绿素，避免吸收多余的能量对光系统造成伤害［33］。低浓度重金属促进小白菜（Brassica chinensis）类胡萝卜素的合成，相反，高浓度能抑制其合成［34］。Pb处理后多年生黑麦草类胡萝卜素没有显著变化，可能是由于植物种类和处理浓度不同的原因。GSH处理后也没有显著变化，而BSO处理后显著低于Pb处理，这证明了当类胡萝卜素处于正常水平时，增加GSH对其合成没有促进作用，而减少GSH会严重影响合成。

气孔限制和非气孔限制是导致Pn降低的两个因素，Pn、Gs和Ci同时下降是气孔因素影响，否则是非气孔因素［24］。本研究中Pb胁迫下Pn、Gs下降，而Ci升高，说明多年生黑麦草Pn下降是非气孔因素引起的，这与前人在紫穗槐（Amorpha fruticosa）上的研究结果一致［35］。Wang等［36］研究发现外源GSH能够缓解镉对两种大麦（Hordeum vulgare）Pn的抑制，同样，多年生黑麦草喷施GSH后Pn也显著增加。喷施BSO后Pn降低，与Mariana等［20］在大豆（Glycine max）上的研究结果一致。

与“表观性”的气体交换参数相比，叶绿素荧光动力学参数可更灵敏地反映出植物叶片光合机构性能的变化［37］。本研究中，Pb胁迫下多年生黑麦草叶片Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm及PIABS均显著下降，类似结果在百喜草（Paspalum notatum）上也得到了证实［38］。Fo下降表明捕光天线系统受到了损伤［39］，Fm、Fv/Fm的下降表明光合电子传递能力和反应中心内光能转换效率下降。Fv/Fo和PIABS的下降意味着PSⅡ的潜在活性和整体性能都在下降。Pb胁迫后喷施GSH，增加了PIABS，表明GSH能够提高多年生黑麦草PSⅡ的整体性能，究其原因，可能与叶绿素含量变化相关。