模式生物大型溞在水生生态毒理实验教学中的应用

巩宁，孟紫强，邵魁双，孙野青

1. 大连海事大学环境科学与工程学院，环境系统生物学研究所，大连 116026 2. 山西大学环境科学研究所，山西大学环境医学与毒理学研究所，太原 030006 3. 国家海洋环境监测中心，大连 116023

水生毒理学是生态毒理学的重要分支。而无脊椎动物是水生生态系统中关键的生物类群，基于无脊椎动物的毒理学测试方法及研究策略也成为水生生态毒理学教学和科研中必不可少的组成部分。

大型溞(Daphniamagna)是节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、枝角目(Cladocera)和溞科(Daphnidae)中个体最大的一种浮游动物。生长于水草繁茂、营养丰富的淡水水体中，在世界范围内广泛分布。作为初级消费者，大型溞是初级生产者和高级消费者之间的纽带，在水生生态系统中具有重要地位。由于易培养、繁殖快、对污染物敏感等特点，大型溞已经作为水生毒理学测试和评估的模式物种，被广泛用于各类化学品(如重金属纳米粒子、有机磷杀虫剂和药物等新型污染物)的水生生物毒性测试和评估中[1-3]，成为水生毒理学测试的重要组成部分。近年来，随着溞类生态学、毒理学和生理学研究的发展，针对溞类的完整水生毒理学研究平台逐渐发展起来[4-6]，溞类水生毒理学在生态毒理学教学中的作用也愈显突出。在孟紫强教授主编的新版《生态毒理学》(中国环境出版集团，2019)一书中，增加了“无脊椎动物毒性测试”(第九章，第四节)的内容，介绍了以大型溞或蚤状溞(D.pulex)为受试生物进行的急慢性毒性试验[7]。系统掌握溞类毒理学研究方法，已经成为生态毒理学及相关学科实验教学中不可或缺的一部分。

本文基于已广泛应用于环境监测和毒理学科研领域的大型溞毒性测试方法和研究策略，试图构建可应用于本科生及研究生教学的水生生态毒理学实验内容，为生态毒理学的教学和人才培养提供参考和借鉴。

1 大型溞的生物学特性与培养方法(The biological characteristics and culture methods of D. magna)

1.1 大型溞的生物学特性

大型溞成体体长2～6 mm，溞体呈宽卵形，左右侧扁，无颈沟。身体被两瓣透明介壳包裹，壳面上具网纹，头部有黑色复眼一个(图1)。第一触角小，第二触角发达，是主要的游泳器官。大型溞雌雄异体，在不良条件下行两性生殖，在适宜条件下可长期孤雌生殖。两性生殖中，雌体所产的卵需受精，称为冬卵。冬卵脱离母体后需经过一定休眠时期才能发育成幼溞。孤雌生殖所产的卵为夏卵，不需受精即可发育成幼溞，且数量较多。在实验室培养条件下，多以孤雌生殖为主[8-9]。

图1 大型溞外部形态Fig. 1 The morphological features of D. magna

1.2 大型溞的实验室培养

目前，针对大型溞的实验室培养已有多种标准方法，如中国的国家标准GB/T 16125—2012[10]、美国材料与试验协会(American Society for Testing and Materials, ASTM)的ASTM 1989[11]、国际标准化组织(International Organization for Standardization, ISO)的ISO 6341[12]以及经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)的OECD 202[5]等。参照这些标准方法，各实验室可依据实际条件进行培养方案的设定。如可设定培养温度为18～22 ℃、光暗周期比为16 h∶8 h。培养用水为能够保证溞类存活的天然水、人工或半人工培养基等。培养用水pH为6～9，硬度(以CaCO3计)为140～250 mg·L-1，在使用前应充分曝气使溶氧浓度达到饱和。每48 h或72 h半量或全量更换一次培养液。

大型溞可以摄食粒径范围在0.7～70 μm的藻类[13]。在实验室培养中，常以近头状伪蹄形藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)和斜生栅藻(Scendesmusobliquus)等为饵料。投喂量为每只动物0.1～0.2 mg C·d-1。藻类可按照OECD推荐的标准方法OECD 201[14]培养，培养条件为22 ℃±2 ℃、光照4 000～8 000 lx、光暗周期比16 h∶8 h。

2 大型溞在实验教学中的应用(Application of D. magna in experimental teaching)

实验教学是培养学生发现、研究和解决问题的有效教学手段，可分为基础性实验、综合性实验及实践性实验。受学时所限，基础性实验大多为验证性项目。一般由教师事先准备好所需实验器材，学生按照步骤操作即可。而综合性和实践性实验教学学时较长(如连续进行1～2周)，可安排学生进行创新性设计和自主性探索，并对实验结果进行综合分析、查找出现错误或失败的原因，更有利于学生创新能力的培养。由于篇幅所限，下文的实验方案仅给出简要描述及适用范围，详情可参考相关标准方法。

2.1 大型溞的外部形态观察、体长测定与生物绘图(2～4学时)

本实验为基础性实验，为后续的溞类毒理学教学提供基本形态学认知。为此，教师在讲授过程中可向学生展示大型溞的图片或视频，以丰富学生的感性认识，并说明生物绘图的基本要点。即强调显微镜观察和绘制同时进行，避免学生参照图片“照猫画虎”、草草了事。本实验适用于水生生物学、浮游动物学等本科实验教学，也可用于水生毒理学实验的前期认知观察。

实验目的：以大型溞为例(如条件允许，也可选择多种枝角类浮游动物进行观察和比较)，了解枝角类浮游动物的外部形态特征(图2)；学习使用体式显微镜进行生物材料的观测；掌握生物绘图的基本技能。

图2 枝角类雌体模式图[15]注：1.颈沟；2.吻；3.头盔；4.壳弧；5.腹突；6.尾刚毛；7.后腹部；8.尾爪； 9.肛刺；10.壳刺；11.夏卵；12.第一触角；13.第二触角；14.大颚；15.上唇； 16.胸肢；17.脑；18.视神经节；19.复眼；20.动眼肌；21.单眼；22.食道； 23.中肠；24.直肠；25.盲囊；26.心脏；27.颚腺；28.卵巢；29.生殖孔。Fig. 2 The pattern diagram of female Cladocera[15]Note: 1. cervical notch; 2. mouth; 3. helmet; 4. lateral head ridges; 5. abdominal processes; 6. postabdominal setae; 7. posterior abdomen; 8. postabdominal claw; 9. anal spines; 10. shell spines; 11. embryo; 12. first antennae; 13. second antennae; 14. mandible; 15. labrum; 16. thoracic appendage; 17. brain; 18. optic ganglia; 19. compound eyes; 20. oculomotor muscle; 21. ocellus; 22. prosogaster; 23. midgut; 24. rectum; 25. caecus; 26. heart; 27. shell gland; 28. ovary; 29. genital pore.

实验方法简介：准备大型溞活体，置于60 mL小烧杯中，每组5～10只，肉眼(或用放大镜)观察大型溞在水中的运动情况。用塑料吸管吸取1只活动正常的健康大型溞，置于载玻片中央，加少许培养液避免完全干燥。将载玻片放置在体式显微镜的载物台上，按照操作规程观察，并绘制大型溞外部形态图。

2.2 理化因素对大型溞心率的影响(2～4学时)

大型溞身体透明，便于观察及测定心率。研究表明，溞类有类似于哺乳动物的肌原性心脏组织，对能影响人类心率变化的一系列受体激动剂和拮抗剂，表现出相似的反应特征[16]。多种环境污染物，如镉离子、全氟辛烷磺酸和四氢嘧啶等，均可导致大型溞心率的紊乱[17-19]。因此，心率观察可作为大型溞的一个易于观测的生理学指标，用于反映各种胁迫条件对水生动物的影响，并可作为反映水质污染程度的生物学指标。在学生实验中，考虑到安全性因素，可选择1%～20%的乙醇溶液作为实验毒物。除此之外，重金属离子、pH(4～11)和盐度(1～8)的变化等也可作为胁迫因素[17]。

实验目的：探究水体中的化学因素(如乙醇)对大型溞的生理影响；通过剂量-效应曲线的绘制及半数效应浓度(effect concentration 50%, EC50)的计算，理解毒理学中的剂量-效应关系。

实验方法简介：选择产自同一母体、生长状态良好、活动正常的大型溞幼溞(<24 h)用于实验。乙醇测试液的浓度分别为1%、5%、10%、15%和20%，并设置空白对照组(清水)。实验时，取1滴清水放在载玻片中央，用吸管吸取1只大型溞放在清水里，放置在体式显微镜下，缓慢盖上盖玻片，用秒表和计数器记录大型溞的心率(可仅记录10 s)；用吸水纸将水吸干，滴加2～3滴1%的乙醇溶液，从盖玻片另一侧用吸水纸吸取乙醇溶液，使大型溞处于乙醇溶液中，5～10 s后，记录大型溞的心率；重复上述步骤，分别记录其他浓度乙醇溶液中大型溞的心率。每个浓度测量3～5只大型溞，并取平均值作为该浓度下的大型溞心率。如大型溞心率过快难以计数，可通过CCD显微摄像等设备辅助记录。

2.3 理化因素对大型溞摄食能力的影响(2～4学时)

水中污染物不仅会影响大型溞的心率，还可能对其摄食能力产生影响，进而对动物的个体生长、繁殖造成干扰，甚至影响到种群的数量。通过对大型溞摄食率和滤水率的测定，可很好地反映其摄食能力的变化[15-16]。本实验可与2.2中的实验内容相结合，设置综合性实验。

实验目的：探究水中污染物对大型溞摄食能力的影响；掌握大型溞摄食行为的测定方法。

实验方法简介：实验用动物与2.2相同。胁迫因素可选择重金属离子、有机污染物和微纳米颗粒等进行暴露处理，本文以镉离子为例进行介绍。在实验前48 h，教师应配制质量浓度分别为0、0.01、0.02、0.05、0.08和0.1 mg·L-1的CdCl2(CdCl2·5H2O，分析纯)溶液，再将实验用幼溞(<24 h)随机置于测试液中，每组加入10只幼溞。向各组中加入初始密度为5×105个·mL-1的普通小球藻(也可用近头状伪蹄形藻、斜生栅藻等代替)，并设置一个空白对照组(仅有数量相同的藻类但无大型溞)。实验开始时，指导学生从各组中移取一定数量大型溞培养液，根据实验条件，选用血球计数板计数法或光密度法测定小球藻的密度。并参考如下公式计算大型溞的滤水率(F)和摄食率(G)：

F=V/N(lnCt-lnCtf)/t

(1)

G=V/N(lnCt-lnCtf)/t·(Ctf-C0)/(lnCtf-lnC0)

(2)

式中：F为滤水率(mL·只-1·h-1)，即单个大型溞单位时间过滤的食物溶液体积；G为摄食率(个·只-1·h-1)，即单个大型溞单位时间摄入的藻细胞数量；V为食物溶液体积(mL)；N为大型溞的数量(只)；C0为起始小球藻浓度(个·mL-1)；Ct为对照组中最终小球藻浓度(个·mL-1)；Ctf为试验组中剩余小球藻浓度(个·mL-1)；t为摄食时间(h)。

指导学生对获得的数据进行统计分析，利用统计软件获得镉离子对大型溞滤水率和摄食率的EC50。

2.4 大型溞活动抑制实验(48 h急性毒性实验)

本实验适用于检测水中化合物的急性毒性。毒理学终点为大型溞的活动抑制(包括死亡)。该实验耗时较长，适用于本科生的综合性和实践性教学。

实验目的：以年龄<24 h的幼溞为实验动物，通过48 h的急性暴露，得到相应时间点的半数致死浓度(lethal concentration 50%, LC50)；掌握大型溞活动抑制的实验方法。

实验方法简介：实验方案可参考标准测试方法[5,10-12]。仍以镉离子为受试化合物进行介绍。在实验开始前，授课教师需进行预实验或查阅相关文献，确定正式试验的浓度范围。为了得到相对完整的剂量-效应曲线，正式实验时可按等比间距设置5个以上镉离子浓度。暴露实验可用小烧杯或六孔板为实验容器。每个浓度设置3个平行，每个平行5只大型溞，暴露溶液至少20 mL，实验期间不喂食。在暴露实验中，每天定时检查大型溞的状况，记录出现的异常情况。在暴露终点(24 h或48 h)，计数活动能力受到抑制(包括死亡)的大型溞数量，计算24 h或48 h的EC50。判断大型溞活动抑制(immobilization)的方法为：轻轻摇动实验容器，如果15 s之内大型溞不能游动，认为其运动能力受到抑制。进一步可通过观察活动抑制个体的心跳，判断大型溞是否死亡。指导学生依据实验结果撰写实验报告。

2.5 大型溞繁殖抑制实验(21 d慢性毒性实验)

在溞类毒理学测试中，如果急性毒性测试确定某测试物具有显著性抑制作用，将进行繁殖抑制实验以确定该测试物的慢性毒性。该实验重点关注以大型溞的繁殖能力为指标的亚致死效应，同样可参照标准测试方法进行实验[6,20]。在这些标准方法中，以21 d为一个周期的慢性毒性测试最为常用。如前所述，枝角类的生活史由交替进行的孤雌生殖世代和两性生殖世代组成，在正常的生活环境下以孤雌生殖为主。只有当环境恶化，如温度变化、食物匮乏或密度过大时，大型溞才会形成冬卵以度过不良环境[9]。本实验室前期研究也表明(未发表数据)，健康幼溞(< 24 h)经过21 d培养，可产生10～30只后代(3～7 d繁殖一次)。因此，在进行本实验前，教师应检查实验用大型溞的培养条件(可参见前文)，保证有足够健康幼溞用于测试。

实验目的：以年龄<24 h的幼溞为实验动物，通过21 d的慢性暴露，得到引起大型溞繁殖抑制的EC50；掌握大型溞繁殖抑制的实验方法。

实验方法简介：所用测试物的浓度将依据已得到的急性测试的半数效应浓度来设置，一般在EC50值以下，按照等比间距设置5个以上浓度。实验用溞仍为来自于同一亲体，溞龄<24 h的幼溞(亲溞)。随机选择健康幼溞，暴露于一定浓度范围的测试溶液中，每只一个容器，实验周期为21 d，暴露期间投喂适量的食物以保证大型溞的生存和繁殖。空白对照组和各浓度测试组均设置10个平行，每个平行1只亲溞，置于玻璃烧杯或六孔板中。每日检查每个容器中的亲溞存活状态及是否有幼溞产生，将幼溞挑出并计数，清理容器中的残饵和蜕皮。试验结束时(21 d)，对每只存活亲溞繁殖的存活幼溞的总数量进行统计(不包括试验期间死亡的幼溞)。还可对其他终点指标进行统计以表示亲溞的繁殖量，如每只亲溞的繁殖次数、亲溞的头胎产溞时间和实验终点亲溞的体长等。最后，通过对暴露于受试物中的亲溞繁殖量与对照组的比较，确定EC50值或最低可观察效应浓度(lowest observed effect concentration, LOEC)和无可观察效应浓度(no observed effect concentration, NOEC)，并指导学生撰写实验报告。

该实验周期长，统计指标多。适合有研究生参与(助课)下的本科生实践教学。通过该实验，可对学生进行完整实验周期的训练，如文献查阅、实验设计、测试液的配制、暴露实验的开展、实验数据的记录、整理和统计等。还可结合2.4中的大型溞活动抑制实验结果，训练学生在实验报告的基础上进行学术论文的撰写。通过训练，不仅可巩固学生对所学的实验技术、方法及原理的掌握，还可以培养学生的创造性思维及独立进行科学研究的能力。

3 展望(Perspective)

本文仅从形态学、生理学和毒性测试角度对以大型溞为实验动物的教学方案进行了设置。但近年来，随着水蚤分子毒理学的建立和发展，大型溞的分子毒理学及组学研究也取得了长足的进步。人们可以利用大型溞的基因组、转录组等信息，对污染物的毒性作用靶点和关键信号通路进行分析，以揭示污染物的损伤作用及毒性机理[21-22]。此外，还可利用表观遗传组学技术，对污染物的代际传递效应进行探讨，进而从种群水平对污染物的生态风险进行评估[23]。上述研究成果均可丰富到实验教学体系中来。例如，可根据研究目的，选择不同的目标分子设计实验，在转录水平、蛋白表达水平或酶的活性水平上进行测试(如胆碱酯酶活性可作为神经毒性测试的分子标志物)，训练学生将分子指标的改变与毒理学、生理学测试结果相结合，进行测试物生物毒性的综合评价。这些综合性的创新实验将有利于培养高级应用型人才，推动生态毒理学教学的发展。

总之，大型溞作为水生无脊椎动物中的模式物种，可为毒理学测试提供准确有效的毒性数据，成为水生毒理学研究中不可缺少的环节。实验教学是培养学生动手能力、创新意识和创造性思维的重要平台，在生物学、环境学和生态学等相关专业的学生实验教学环节中，引入和建立以大型溞为实验材料的实验教学体系，是可行并且必要的。在实验教学内容的编排上，可本着由易而难的原则，兼顾基础和前沿，根据课时要求对上述实验内容酌情增减，以满足不同程度学生的教学需求。