沉积物中无机硒对霍甫水丝蚓的生物效应研究

李潇，李丹，罗艺璇，杨纪琛，刘洪宋，雷浩俊，陈红星,*，谢凌天

1. 华南师范大学环境研究院，广东省化学品污染与环境安全重点实验室，环境理论化学教育部重点实验室，广州 510006 2. 华南师范大学环境学院，广州 510006

沉积物是水体环境污染物的主要的汇，同时沉积物也是底栖动物生活的主要场所，底栖动物通过生物扰动等可加速污染物从沉积物向水体的迁移，使得沉积物成为水体污染物的源[1]。此外，沉积物也是多种等寡毛纲底栖动物的主要食物来源，其通过吞吐和消化沉积物，从沉积物中获取有机质等食物，但其中的污染物也常常被摄入体内，对生物体及水生食物链造成潜在危害和风险[2-3]。

硒是动物体必需微量元素之一，低剂量硒常具有拮抗氧化应激的作用，并抑制亲巯基二价金属离子的生物累积和毒性(如汞、镉和铅等)，但是过量硒对生物体又可产生一定的毒性效应[4-7]。研究显示，对于无脊椎动物而言，过量硒的毒性和汞毒性相当，且远大于镉的毒性[8]。水体中硒主要以无机硒形态存在，其中主要是Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)[9]，土壤及沉积物中无机硒主要形态也以Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)为主[10-12]。研究表明，沉积物中硒主要分布于表层(～90%)，硒浓度一般低于1 μg·g-1(干质量)，并随深度降低(如深度30 cm处浓度仅～0.3 μg·g-1干质量)，而富硒或硒污染底栖环境硒浓度可达4～30 μg·g-1(干质量)[13]。痕量元素的迁移性和生物可利用性与其化学形态密切相关，序列提取分析表明，硒非残渣态在总含量中所占的比例相对较高，有着较高的生物可利用性和潜在生态风险[10-11]。

底栖动物群落的稳定性，在很大程度上反映了整个水生态系统的健康程度[14]。底栖动物定量定点采集容易，其运动不敏捷，可真实反映固定区域的污染水平，其种类的多样性比鱼类大，对水体污染的耐受性和适应性因种类或分类群的不同而有较大变化，因而底栖动物可在河流生态评价中用作指示生物，欧美国家也已将底栖动物作为水质指示动物[15]。此外，通过底栖动物进行生物监测可了解到水质的长期变化，综合表征污染物的毒性。水环境中部分摇蚊幼虫[1]和寡毛纲少数种(如霍甫水丝蚓)等被广泛用来作为水体污染指示生物[2]。

食物相硒是过量硒毒性的主要作用途径[5, 16]。底栖食物网中，水体底栖生物中的硒是食物链硒传递和累积的重要一环[17]。霍甫水丝蚓为底栖环境的优势种之一，作为耐污种在水生态评价中具有重要地位[16,18]。以往研究多认为底栖动物对污染物耐受性较高，其本身只是作为污染物在食物链中传递的媒介，其本身受到的影响研究很少。我们前期探讨了霍甫水丝蚓对沉积物中无机硒的扰动作用，发现霍甫水丝蚓可以通过打洞和摄食等方式改变沉积物/水界面硒的分布[16]。反之，沉积物中无机硒是否对其中的底栖动物造成一定的生态风险有待研究。因此，本研究将典型底栖动物霍甫水丝蚓暴露于2种无机硒(Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ))，通过测定抗氧化系统(TBARS、CAT、SOD和GST)、神经系统(AChE)和消化系统(α-葡糖苷酶)酶活性的变化，探讨无机硒对底栖动物的生物效应，为沉积物中无机硒对底栖动物的生态风险评价提供基础数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料

霍甫水丝蚓购自广州市水产市场，在实验室中于18 L玻璃缸中暂养。水丝蚓暴露实验所用溶液根据ASTM标准进行配制(48 mg·L-1NaHCO3，30 mg·L-1CaSO4·2H2O，30 mg·L-1MgSO4，2 mg·L-1KCl，pH 7.4)。实验开始1周前挑选体长大致等同的霍甫水丝蚓成体，将水丝蚓转移至实验条件下适应环境，每天喂食少量粉末饲料(tetramin)，饲料含粗蛋白>47%，粗脂肪>10%，粗纤维<3%，水分<6%，磷>1%，维生素A>15 000 IU·kg-1，维生素B12 110 mg·kg-1，维生素C 390 mg·kg-1，维生素D3 1 400 IU·kg-1，维生素E 140 IU·kg-1，烟酸700 mg·kg-1，肌醇1 400 mg·kg-1，胆碱2 100 mg·kg-1，生物素>1 mg·kg-1，Omega-3脂肪酸8 000 mg·kg-1。

实验所需所有容器均在实验前于50%硝酸溶液中清洗，并由超纯水冲洗后烘干使用。亚硒酸钠(Na2SeO3，Se(Ⅳ))和硒酸钠(Na2SeO4·10H2O，Se(Ⅵ))购于Sigma-Aldrich (美国)。

1.2 硒沉积物暴露

实验所需沉积物取自广州水源地(113°47'42"N，23°46'01"E)，实验开始前将沉积物过筛(500 μm)，-80 ℃冷冻杀灭其中的生物，48 h后解冻，沉降并去除上覆水对沉积物进行检测。沉积物水分含量为56%，总氮(TN)、总磷(TP)、氨(NH4+)和总有机碳(TOC)含量分别为0.15%、0.05%、0.01%和2.1%。烘干后检测其砂含量为0.5%，粉砂含量为40.8%，黏土含量为58.7%。所用沉积物总硒背景值约为0.2 μg·g-1(干质量)[16]。

本实验共设置9个处理组：空白对照组，4个Se(Ⅳ)处理组(2、5、20和40 μg·g-1干质量)，4个Se(Ⅵ)处理组(2、5、20和40 μg·g-1干质量)，每个处理组设6个平行，共54个烧杯。其中，3个平行(27个烧杯)用于暴露2周后的测定，另外3个平行用于暴露2个月后的测定。通过计算沉积物含水量，分别向处理组加入一定量对应形态的硒母液并搅拌均匀。室温条件下平衡48 h，随后将沉积物分放在酸洗过的1 L玻璃烧杯中，每个烧杯放入约450 g沉积物(湿质量)，沉积物高度约为2.5 cm。每个烧杯加入如上配制的ASTM标准溶液600 mL，并用记号笔标识液面位置。随后，每个烧杯中放入2 g霍甫水丝蚓(约200条)。光照周期为16 h光照∶8 h黑暗，水丝蚓硒暴露期间不喂食(水丝蚓以沉积物中有机质为食)，不曝气，每隔2 d加入适量纯水(DI水)至标识的液面位置，避免上覆水体积由于挥发等因素造成大幅波动。

暴露2周和2个月后，分别收集各烧杯中的水丝蚓，在干净的配制水中清空肠道6 h。随后，用纸拭干水丝蚓体表水分，称量质量，于-80 ℃冰箱保存，用于各个生化指标的测定。

1.3 生化指标检测

每个生化指标测定均选取约20 mg水丝蚓，测定采用6个重复(n=6)。将各组织样品按1∶9质量体积比(1 mg∶9 μL)加入预冷生理盐水，冰浴匀浆，离心取上清备用。脂质过氧化水平和酶活性测定均采用96孔板法于酶标仪(Tecan Infinite M200)进行测定，根据物质特性选择相应波段确定其浓度与吸光度的关系，具体步骤参考本实验室近期研究中的方法进行[19-21]。生化指标包括抗氧化系统中脂质过氧化水平、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性，神经系统中乙酰胆碱酯酶(AChE)活性，以及消化系统中α-葡萄糖苷酶(α-Glu)活性。脂质过氧化水平通过测量硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)含量来确定，结果表示为nmol·mg-1protein。酶活性的单位定义为单位总蛋白浓度对应的酶活性(mU·mg-1protein或U·mg-1protein)，总蛋白浓度用Bradford方法进行测定。

1.4 数据分析

图中数据为平均值±标准误差(Mean±SE)，采用GraphPad Prism 8.0对数据进行统计分析和作图，用Kolmogorov-Smirnov和Levene方法检验数据的正态性和方差齐性。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey法进行分析及多重比较(显著性水平为P<0.05)。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 硒暴露对霍甫水丝蚓抗氧化系统的影响

2.1.1 硒暴露对霍甫水丝蚓脂质过氧化水平的影响

霍甫水丝蚓在硒暴露后，体内脂质过氧化水平(TBARS含量)受到暴露时间的影响较大，而受到价态的影响较小。暴露2周后，水丝蚓体内TBARS水平整体是升高趋势，在2～20 μg·g-1浓度区间有一个明显的上升峰值，且在5 μg·g-1和40 μg·g-1这2个浓度处理组显著升高，5 μg·g-1暴露组远高于40 μg·g-1暴露组(图1(A1))；暴露2个月后，TBARS水平在2～20 μg·g-1浓度区间有一个降低的峰值，随后随着浓度升高逐渐恢复到对照组水平(图1(B1))。

水丝蚓体内TBARS水平在暴露2周后升高，可能是由于水丝蚓对于Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的应激反应，导致体内脂质过氧化水平升高。无机硒进入水丝蚓体内，进行一系列氧化-还原反应，从而生成过量自由基，造成一定的胁迫效应[3,5,22]。研究表明，夹杂带丝蚓(Lumbriculusvariegatus)暴露于20 μg·g-1Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ) 2周后，体内TBARS水平显著升高[3]，而0.6 μg·g-1Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露可显著提高仿刺参(Stichopusjaponicas)体内耗氧率[23]，提示硒的短期暴露对自由基水平的促进作用。随着暴露浓度的升高，水丝蚓体内TBARS水平并不是线性升高，而仅在5 μg·g-1和40 μg·g-1暴露组显著高于对照组，且低浓度暴露组(5 μg·g-1)高于高浓度暴露组(40 μg·g-1)，表明5 μg·g-1暴露条件下，水丝蚓对硒的吸收和转化较为迅速，可能属于主动吸收阶段；而在最高浓度40 μg·g-1条件下，过高的硒浓度可能造成其体内抗氧化系统的损伤，水丝蚓对于硒的吸收转为被动吸收阶段，从而通过降低生物累积因子等[16,24]途径降低过量硒对生物体的毒性效应。安德爱胜蚓(Eiseniaandrei)通过滤纸接触法暴露于Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ) 48 h后，其体内TBARS水平也显著升高，和本研究结果类似，该研究也发现这2种无机硒对蚓体TBARS水平的诱导不是线性变化，而是仅在中间浓度(0.5 μg·cm-2)和最高浓度(5 μg·cm-2)有显著升高[25]。而暴露2个月后，低浓度硒暴露似乎对水丝蚓有一定的有益作用(2～20 μg·g-1)，表现为脂质过氧化水平的降低，而高浓度又逐渐升高其体内脂质过氧化水平，暗示过量硒暴露条件下，硒有益效应的消失或者毒性效应的出现[4,7]。

2.1.2 硒暴露对霍甫水丝蚓抗氧化酶活性的影响

水丝蚓体内3种抗氧化酶活性(CAT、SOD和GST)在暴露2周后，其变化趋势相似，但是Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露组差异明显。Se(Ⅳ)暴露后，抗氧化酶活性随着暴露浓度逐渐升高，并在20～40 μg·g-1达到平衡；而Se(Ⅵ)暴露后，抗氧化酶活性在5 μg·g-1达到峰值，并随后逐渐降低到对照组水平(图1(A2)～(A4))。有趣的是，硒暴露2个月后，水丝蚓体内3种抗氧化酶的活性基本仅受到硒暴露浓度的影响，而不受硒价态的影响(图1(B2)～(B4))(除2 μg·g-1处理组的SOD外)，其中，CAT酶活性在5 μg·g-1显著降低，SOD酶活性在2～5 μg·g-1升高，GST酶活性和对照组没有差异。

图1 硒暴露对霍甫水丝蚓抗氧化系统的影响注：A表示Se(Ⅳ)暴露组和对照组存在显著差异，a表示Se(Ⅵ)暴露组和对照组存在显著差异， *表示Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露组存在显著差异(P<0.05)。Fig. 1 The effects of selenium exposure on the antioxidant system of L. hoffmeisteriNote: A denotes significant differences between the Se(Ⅳ) treatment and control; a denotes significant differences between the Se(Ⅵ) treatment and control; *denotes significant differences between Se(Ⅳ) and Se(Ⅵ) treatments (P<0.05); TBARS means thiobarbituric acid reactive substances; SOD means superoxide dismutase; CAT means catalase; GST means glutathione S-transferase.

Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的化学性质不同，可能导致不同价态硒的短期暴露(2周)生物效应差异。二者在生物体内的还原过程虽然类似，但是Se(Ⅵ)需要先被还原为Se(Ⅳ)，然后才能进行下一步的还原过程，同等条件下Se(Ⅵ)可以造成更多的氧自由基的产生[26-27]。因此，可能造成了Se(Ⅵ)在较低浓度如5 μg·g-1即造成了抗氧化酶活性的显著升高，且随着Se(Ⅵ)浓度升高，迅速超过机体的抗氧化能力，从而造成抗氧化系统的失衡及抗氧化酶活性的降低；而Se(Ⅳ)的还原可能产生较少的氧自由基，因此Se(Ⅳ)在20 μg·g-1才造成抗氧化酶活性的显著升高。

暴露2个月后，水丝蚓体内抗氧化酶活性的变化和暴露2周差异较大。类似研究表明，泥鳅(Misgurnusanguillicadatus)暴露于4.6～18.4 mg·L-1的Se(Ⅳ)2～3 d后，体内抗氧化酶活(SOD、GST等)明显升高，暴露4 d后恢复到对照组水平[28]；沙蚕(Nereisdiversicolor)暴露于3.7 μg·g-1Se(Ⅳ)5 d后，体内谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性升高，暴露10 d后也恢复到对照组水平[29]，这些研究表明，硒对抗氧化系统的影响受到暴露时间的显著影响。此外，硒长期暴露后价态的影响几乎消失，可能和硒的生物转化和价态变化等因素有关[27]，具体机制有待进一步研究。

2.1.3 硒暴露对霍甫水丝蚓的双重生物效应

2.1.3.1 有益效应

适量硒对生物体有一定的有益效应，具有抗氧化等作用。本研究显示，暴露2个月后，水丝蚓体内TBARS水平在2～20 μg·g-1浓度范围降低。类似研究表明，桑蚕(BombyxmoriL.)在第5幼虫期后摄食酵母硒(4～32 μg·g-1，7 d)，可增加其体质量及所产幼蚕的数量[30]。硒对多种重金属的生物累积和毒性还具有拮抗作用，硒可通过抗氧化作用降低金属产生的过量自由基，硒预暴露可降低铜在夹杂带丝蚓体内的累积和TBARS水平[6]，还可降低镉在小鳉鱼(Heterandriaformosa)体内的累积和TBARS水平[5]。也有研究认为无机硒如Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)为阴离子，进入生物体后，可和阳离子金属形成硒-金属-蛋白复合体，改变金属对生物大分子的活性位点，降低金属的毒性效应[31]，如2～10 μg·g-1Se(Ⅳ)可以降低锑元素在赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)体内的累积和毒性[31]；15～50 μg·g-1Se(Ⅳ)可降低夹杂带丝蚓体内汞的累积(～80%)等[32]。

值得注意的是，硒的有益浓度范围较窄，并且过高或过低可以引起硒的毒性效应[4]。本研究中霍甫水丝蚓在硒暴露2周和2个月后，在2～20 μg·g-1浓度区间均存在峰值。已有的研究也显示，刺参(Apostichopusjaponicus)摄食硒饵料28 d，适宜酵母硒浓度(0.8～1.6 μg·g-1)可以提高其免疫能力及抗氧化酶活性，而低浓度(0.2 μg·g-1)和高浓度(3.2～6.4 μg·g-1)均没有促进作用[33]。蚯蚓(Dendrobaenaveneta)暴露于Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ) 15 d后，CAT只在适宜浓度(0.1 μg·g-1)降低，而在低硒(0.01 μg·g-1)和高硒(1 μg·g-1)浓度均和对照组无差异[34]。这些研究表明，硒作为动物体必需元素之一，其添加量必须控制在一个合理范围。

2.1.3.2 毒性效应

过量硒对生物体的毒性效应也不容忽视。研究表明，对无脊椎动物如刺参幼参来说，硒和汞同属于剧毒物质，其毒性远高于镉[8]。不少研究报道了过量硒的毒性效应，赤子爱胜蚓暴露于46 μg·g-1Se(Ⅳ) 49 d后，其种群数量降低了约1/3[35]；白蚯蚓(Enchytraeuscrypticus)暴露于6.2 μg·g-1Se(Ⅵ) 28 d后，其种群数量也降低了约50%[36]；秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)暴露于78.9 μg·g-1Se(Ⅳ) 9～55 h后(全生命周期)，不同生长期生长及繁殖均受到抑制[37]。

此外，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)对底栖动物的毒性存在差异。霍甫水丝蚓暴露于硒2个月后，5 μg·g-1Se(Ⅳ)降低了其种群数量约1/4，而>20 μg·g-1Se(Ⅵ)才开始降低其种群数量[16]。在安德爱胜蚓硒的48 h急性毒性实验中，也发现Se(Ⅳ)的毒性约为Se(Ⅵ)的4.6倍[25]。在过量硒存在的条件下，Se(Ⅳ)对无脊椎动物的毒性高于Se(Ⅵ)，可能和其较高的生物累积速率[16]和较快的生物还原过程等[3]因素相关。

2.2 硒暴露对霍甫水丝蚓神经酶活性的影响

硒暴露2周后，霍甫水丝蚓体内AChE酶活性受影响较小，只有5 μg·g-1Se(Ⅳ)暴露增加了水丝蚓体内AChE酶活性，而暴露2个月后，随着浓度升高，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)都降低了水丝蚓体内AChE酶活性，且在5～40 μg·g-1达到平衡状态。总体而言，霍甫水丝蚓体内AChE酶活性几乎没有受到硒价态差异的影响。此外，对照组霍甫水丝蚓体内AChE酶活性的平均水平在不同暴露时间段有较大变化，2个月后其体内AChE酶活性普遍高于2周，可能受到不同生长阶段的影响(图2)。

图2 硒暴露对霍甫水丝蚓神经酶活性的影响注：A表示Se(Ⅳ)暴露组和对照组存在显著差异，a表示Se(Ⅵ)暴露组和对照组存在显著差异(P<0.05)。Fig. 2 The effects of selenium exposure on the nervous enzyme of L. hoffmeisteriNote: A denotes significant differences between the Se(Ⅳ) treatment and control; a denotes significant differences between the Se(Ⅵ) treatment and control (P<0.05); AChE means acetylcholinesterase.

硒暴露会降低无脊椎动物AChE酶活性的结果已有报道，Se(Ⅳ)可以降低沙蚕(3.7 μg·g-1，5～10 d)[29]和蚯蚓(0.1 μg·g-1，15 d)[34]体内AChE酶活性；Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)可降低安德爱胜蚓体内AChE酶活性[25]。由于物种差异性，虽然这些生物对硒的响应浓度不同，但是硒对AChE酶活的抑制可能存在某些共用途径。硒本身可以作为抗氧化剂，适量硒可以消除体内多余的氧自由基[38]，而神经系统的信号传导等功能对氧自由基有很强的依赖性的[39]，暗示硒通过调节自由基水平对神经系统通路及酶活性产生影响。这也和本研究的结果吻合，硒暴露2周和2个月后，AChE酶活性的变化趋势和TBARS的变化趋势基本吻合(特别是2～20 μg·g-1区间)，相关性分析也显示二者存在一定程度的线性关系(图3)，进一步表明AChE酶活性可能受到氧自由基水平的调控。

图3 霍甫水丝蚓体内脂质过氧化水平和乙酰胆碱酯酶活性相关性分析Fig. 3 The correlation analysis between the levels of TBARS and the activities of AChE in L. hoffmeisteri

2.3 硒暴露对霍甫水丝蚓消化酶活性的影响

硒暴露后，硒对霍甫水丝蚓消化酶活性的影响较小，仅在5 μg·g-1浓度增加了α-葡糖苷酶的活性，随着浓度升高，其促进作用逐渐消失并恢复到对照组水平，表明只有适宜浓度的硒才可促进其消化酶活性。有趣的是，短期暴露只有Se(Ⅳ)增加了该酶的活性，而长期暴露后，只有Se(Ⅵ)增加了该酶的活性(图4)。

图4 硒暴露对霍甫水丝蚓对消化酶活性的影响注：A表示Se(Ⅳ)暴露组和对照组存在显著差异，a表示Se(Ⅵ)暴露组和对照组存在显著差异， *表示Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)暴露组存在显著差异(P<0.05)。Fig. 4 The effects of selenium exposure on the digestive enzyme of L. hoffmeisteriNote: A denotes significant differences between the Se(Ⅳ) treatment and control; a denotes significant differences between the Se(Ⅵ) treatment and control; *denotes significant differences between Se(Ⅳ) and Se(Ⅵ) treatments (P<0.05); α-Glu means α-glucosidase.

硒对无脊椎动物消化酶活性影响的研究相对较少。已有的研究主要集中于酵母硒对一些水产动物消化酶的影响，如酵母硒在适宜浓度(0.8～1.6 μg·g-1)可以增加刺参体内蛋白酶和淀粉酶活性，而硒浓度过低(0.2 μg·g-1)或过高(6.4 μg·g-1)时酶活性均恢复到对照组水平[40]。虽然有研究表明，对于刺参而言，有机硒对消化酶的促进作用大于无机硒[41]，但自然水体和沉积物中硒主要以Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)等形态存在[9-12]，这些无机硒对底栖无脊椎动物消化酶的影响可能具有更高的生态学意义。硒对水生动物体内消化酶活性的促进作用，可能和硒对其代谢、生理状况和氧化还原等稳态的维持有关，从而相应增加其消化能力。此外，消化酶活性对不同价态硒以及不同暴露时间的响应存在差异，本研究结果显示，5 μg·g-1Se(Ⅳ)可以在较短暴露期就增加水丝蚓体内α-Glu的活性，而长期暴露后，Se(Ⅳ)对该酶的促进作用消失，反而5 μg·g-1Se(Ⅵ)才能够增加该酶的活性。同样，这可能和不同价态硒在生物体内的累积速率、代谢速率和生物转化存在差异等因素有关。例如，前期研究发现，霍甫水丝蚓在含20～40 μg·g-1浓度Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的沉积相中暴露2个月后，Se(Ⅳ)暴露组虫体内硒含量远高于Se(Ⅵ)暴露组，表明不同价态硒在水丝蚓体内的累积速率存在显著差异[16]。

综上所述，2种无机硒均可以对霍甫水丝蚓抗氧化系统、神经系统和消化系统等造成显著影响，且存在暴露浓度、暴露时间及硒价态的差异。沉积物中适宜硒含量(2～5 μg·g-1)对霍甫水丝蚓的生理状况有益，而高浓度硒(Se(Ⅳ)>5 μg·g-1，Se(Ⅵ)>20 μg·g-1)对其造成一定的毒性效应。硒对底栖无脊椎动物的生物效应受到多种因素的调节，其内在机制有待进一步探讨。