促红细胞生成素衍生肽抑制自噬和凋亡减轻阿霉素诱发的心脏毒性

安慧仙,李 炜,方 东,孙 闯,张晓东,王 伟,李同华,曾广伟*

(1西安国际医学中心医院心脏病医院心血管内科,西安 710100;2西安市第一医院心血管内科;*通讯作者,E-mail:zengguangwei1026@163.com)

阿霉素(doxorubicin,DOX)是一种被广泛使用的抗癌药物,其常见适应证包括血液癌症(如白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)和实体器官癌(如乳腺癌、甲状腺癌、肉瘤、骨肉瘤等)[1-3]。然而,尽管DOX是治疗不同类型癌症的一线抗癌药物,但DOX的治疗会剂量依赖性地引起严重心脏毒性和耐药性,这成为限制DOX临床应用的主要瓶颈因素。DOX导致的心脏毒性可表现为急性心脏损伤,也可表现为慢性的左室功能障碍、扩张型心肌病和心力衰竭[4]。而急性心脏毒性与心肌细胞质空泡化、线粒体膜脂质过氧化和肿胀、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)增加以及染色质和DNA结构破坏有关[5,6]。此外,DOX导致的线粒体、肌质网等细胞器以及大分子损伤和ATP含量的降低均能启动自噬过程。因此,探讨自噬在DOX诱发心脏毒性中的作用,并寻找可以防治DOX心脏毒性的药物对于DOX的临床应用至关重要。

促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是一种内源性蛋白,临床上用于治疗由慢性肾病、人类免疫缺陷病毒和化疗引起的贫血,这种激素也被用来限制手术输血的次数[7,8]。尽管EPO对很多器官组织有保护作用,但需要很高的剂量,这会引发严重的副作用,如血栓形成、中风和高血压。螺旋B表面肽(helixb surface peptide,HBSP)是从EPO螺旋B的水表面衍生出来的11个氨基酸序列,最近被证明具有很强的心血管保护作用[9]。长期服用HBSP可改善心肌梗死后扩张型心肌病的进展[10]。同时,最新研究表明HBSP能通过激活PI3K/Akt信号改善表柔比星诱导的大鼠心肌损伤[11]。然而HBSP在改善DOX诱发的心脏毒性中的作用及机制还未见报道,有待进一步研究。因此,本研究采用小鼠腹腔注射DOX,探讨HBSP对DOX诱发心脏毒性的保护作用及对自噬的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

36只8周龄健康雄性C57BL/6小鼠购买于西安交通大学实验动物中心,体质量25-30 g。HBSP购买于上海科肽生物科技有限公司,依据文献确定其浓度[12],肌钙蛋白T(cTnT)试剂盒购于南京建成生物公司,DOX购买于Sigma公司,Caspase-3、cytochrome C、cleaved Caspase-3、Caspase-9、LC3B、Beclin1、LAMP2和p62抗体购买于Cell Signaling Technology公司,β-actin、山羊抗兔和山羊抗鼠抗体购买于北京中衫金桥公司。

1.2 实验分组和建立动物模型

将购买的36只C57BL/6小鼠在动物房适应性喂养3 d,为了观察HBSP对DOX心脏毒性的作用,将小鼠随机分为3组,每组12只:①对照组(control):腹腔注射生理盐水;②DOX组:一次性腹腔注射DOX(15 mg/kg);③DOX+HBSP组:一次性腹腔注射DOX(15 mg/kg),并腹腔注射30 μg/(kg·d)的HBSP,连续7 d。模型建立的方法和药物注射浓度均参照以往文献的报道[9,12]。

1.3 心脏血流动力学指标的检测

DOX引起心脏功能损伤是其诱发心脏毒性的一个重要表现。DOX注射7 d后,用异氟烷麻醉小鼠,体视显微镜下分离颈动脉,穿线结扎远端,在颈动脉做一小切口,将连有压力传感器的动脉套管针沿切口插入颈动脉至心室,采用多道生理记录仪测量左室压力上升最大速率(+dP/dtmax)和左室压力下降最大速率(-dP/dtmax),检测各组小鼠心脏的收缩和舒张功能。

1.4 心脏HE染色检测心脏结构

DOX会引起心脏结构的病理性改变,DOX注射7 d后,用异氟烷麻醉小鼠,快速取出心脏放置于预冷PBS中冲洗以去除血液,再将心脏放入4%多聚甲醛过夜固定;常规脱水复蜡、石蜡包埋和切片;二甲苯和梯度酒精脱蜡复水,采用常规苏木精和尹红染色方法,中性树胶封片。普通光学显微镜观察各组染色情况。

1.5 ELISA检测血清中cTnT的含量

DOX注射7 d后,用异氟烷麻醉小鼠,将小鼠固定在手术台上,剪开颈部皮肤,暴露颈动脉并剪口取血;2 000g离心10 min,取上清冻存于-80 ℃备用。严格按照南京建成生物公司cTnT检测试剂盒说明书操作,分光光度计读取各组血清的吸光值并计算出各组血清cTnT的含量。

1.6 Western blot检测Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cytochrome C、Beclin1、P62、LAMP2和LC3B蛋白的表达

称取各组小鼠相同质量的左室组织,先用预冷的PBS 2 000g离心10 min,弃上清,沉淀中按照1 ∶5的比例加入裂解液(含蛋白酶抑制剂和RIPA),用研磨器在冰上研磨裂解30 min,12 000g、4 ℃离心30 min,保留上清,BCA法蛋白定量;配制SDS-PAGE胶,每孔上样40 μg,常规电泳、转膜将蛋白转移至PVDF膜;5%脱脂奶粉室温封闭2 h,将目的蛋白剪下并放入相应的抗体管中:Caspase-3(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)、Caspase-9(1 ∶1 000)、cytochrome C(1 ∶1 000)、Beclin1(1 ∶1 000)、P62(1 ∶1 000)、LAMP2(1 ∶1 000)、LC3B(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶5 000),4 ℃过夜;次日,TBST洗涤3次,每次10 min,用HRP标记的二抗(1 ∶5 000)室温孵育2 h,TBST洗涤3次,每次10 min;Bio-rad发光仪化学发光,并用Image Lab软件对条带灰度进行分析并统计,β-actin作为内参。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 HBSP改善DOX诱发的心脏功能损伤

与control组比较,DOX组小鼠心脏+dP/dt和-dP/dt明显降低(P<0.05),说明DOX组小鼠心脏收缩和舒张功能均受损;与DOX组比较,HBSP+DOX组HBSP处理后+dP/dt和-dP/dt明显增加(P<0.05,见图1),表明HBSP能改善DOX诱发的心脏功能损伤。

与control组比较,*P<0.05;与DOX组比较,#P<0.05图1 各组心脏功能的比较Figure 1 Comparison of cardiac function among three groups

2.2 HBSP改善DOX诱发的心脏形态损伤

由HE染色和血清cTnT检测结果可以看出,control组心肌纤维排列整齐,没有空泡化现象,血清中cTnT含量很低;而DOX组心肌纤维出现部分断裂、排列不规则并出现空泡化,同时血清中cTnT含量明显增加(P<0.05,见图2);与DOX组比较,HBSP+DOX组HBSP处理后心肌纤维排列、减轻空泡化明显改善,并血清中cTnT含量明显降低(P<0.05,见图2)。

与control组比较,*P<0.05;与DOX组比较,#P<0.05图2 各组小鼠心脏形态和血清cTnT含量的比较Figure 2 Comparison of cardiac structure and serum cTnT content among three groups

2.3 HBSP抑制DOX诱发的心肌细胞凋亡

Western blot结果可以看出,与control组相比,DOX组cleaved Caspase-3、Caspase-3、Caspase-9和cytochrome C的表达明显增加(P<0.05);与DOX组比较,HBSP+DOX组HBSP处理后cleaved Caspase-3、Caspase-3、Caspase-9和cytochrome C的表达明显减少(P<0.05,见图3)。

与control组比较,*P<0.05;与DOX组比较,#P<0.05图3 各组cleaved Caspase-3、Caspase-3、Caspase-9和cytochrome C的表达Figure 3 Expression of cleaved Caspase-3, Caspase-3, Caspase-9 and cytochrome C in each group

2.4 HBSP抑制DOX诱发的心肌细胞自噬

与control组相比,DOX组LC3BⅡ/LC3BⅠ比值、Beclin1、P62和LAMP2的表达明显增加(P<0.05);与DOX组比较,HBSP+DOX组HBSP处理后LC3BⅡ/LC3BⅠ比值、Beclin1、P62和LAMP2的表达明显降低(P<0.05,见图4),这说明HBSP能改善DOX引起的心肌细胞自噬功能障碍。

与control组比较,*P<0.05;与DOX组比较,#P<0.05图4 各组Beclin1、P62和LAMP2的表达以及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值的比较Figure 4 Expression of Beclin1, P62 and LAMP2 and the ratio of LC3BⅡ/LC3BⅠ in each group

3 讨论

DOX的心脏毒性和耐药性严重制约了DOX作为抗癌药物的临床应用。尽管以往的很多报道提出了一些研究理论[13],以更好地阐明DOX诱导的心脏毒性和耐药性的机制,但遗憾的是,还没有一个明确的潜在机制转化为临床应用。DOX心脏毒性作用相关的两个比较明确和主要的机制包括自由基的生成以及对细胞DNA和不同细胞内蛋白的损伤,破坏拓扑异构酶介导的DNA修复[14,15]。另外,钙稳态失调、线粒体损伤和凋亡也被认为是DOX诱发心脏毒性的重要因素。

DOX剂量依赖的心脏毒性会导致不可逆心力衰竭,然而其病理机制尚未完全阐明。使用DOX治疗时,很多患者会出现左心室功能进行性降低,并最终进展为充血性心力衰竭。而左室功能障碍和结构损伤是DOX导致心脏毒性的重要病理表现[16]。在本实验中,DOX腹腔注射7 d后,小鼠心脏+dP/dt和-dP/dt明显降低,同时,心肌纤维部分断裂并出现空泡化,血清中cTnT含量明显增加,说明DOX能损伤心脏的收缩和舒张功能,并导致心肌纤维病理性改变。而给予HBSP处理后,小鼠心脏+dP/dt和-dP/dt显著增加,心肌纤维结构改善,空泡化减少,血清中cTnT含量降低。这些结果证明HBSP能改善DOX引起的心脏毒性。

越来越多的证据表明[17],DOX会引起心肌细胞凋亡,导致心肌细胞数量减少[18]。作为促凋亡蛋白,Caspase-9可以活化并剪切Caspase-3成为cleaved Caspase-3,同时,Caspase-9和cytochrome C形成凋亡体并介导cytochrome C由线粒体释放到胞质,这些过程在细胞凋亡中发挥至关重要的作用[19]。本实验结果表明,DOX处理后cleaved Caspase-3、Caspase-3、Caspase-9和cytochrome C的蛋白表达明显增加,说明心肌细胞凋亡增加,这与以往的研究结果一致[6]。而给予HBSP处理,可使cleaved Caspase-3、Caspase-3、Caspase-9和cytochrome C的蛋白表达明显降低,这说明HBSP能明显减轻DOX诱导的心肌细胞凋亡。

自噬是真核细胞中一种保守的循环利用受损细胞器和蛋白质的机制,由溶酶体介导的一种分解代谢途径,在维持细胞内稳态和细胞存活中起着至关重要的作用[20]。完整的自噬过程即自噬流包括自噬小体的形成,与溶酶体结合形成自噬溶酶体以及将自噬溶酶体内的底物降解,而LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1、P62和LAMP2在自噬的这几个阶段发挥了关键作用,是自噬流检测的标志蛋白[21]。自噬参与多种生理和病理过程,包括抗衰老、肿瘤抑制、蛋白质质量控制和细胞死亡调控。根据以往报道,自噬功能受损,无论是自噬抑制或过度激活,都会损害心脏功能[22]。本实验结果发现,DOX腹腔注射7 d后会导致自噬相关蛋白LC3BⅡ/LC3BⅠ比值、Beclin1、P62和LAMP2的表达明显增加;而HBSP处理后可显著降低LC3BⅡ/LC3BⅠ比值、Beclin1、P62和LAMP2的表达,这说明HBSP可改善DOX引起的自噬流功能障碍。因此,这些结果表明HBSP调控自噬可能是治疗DOX诱导心脏毒性的潜在策略。

综上所述,本实验的结果表明细胞凋亡和过度自噬是DOX诱导心脏毒性的重要机制。而HBSP可以减轻DOX诱导的心脏毒性,其发挥保护作用的机制是通过抑制细胞凋亡和过度自噬实现的。本研究为阐明DOX诱导心脏毒性的机制提供了实验证据,并为HBSP治疗DOX诱导的心脏毒性提供了新的实验和理论依据。