黄尾鲴溃疡综合征的病原菌分离鉴定及病理学观察

王荣华，刘益莎，符艳纯，张润春，周 勇，罗玉双，刘 飞，陈中元

( 1.湖南文理学院，水生动物重要疫病分子免疫技术湖南省重点实验室，环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室，常德市农业生物大分子研究中心，湖南 常德 415000；2.中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉 430223 )

黄尾鲴(Xenocyprisdavidi)属鲤科、鲴亚科、鲴属，俗称黄尾、黄片、黄瓜鱼等，是一种底栖的中小型淡水鱼类，在我国的长江、珠江和闽江等地区各溪流中均有分布[1]。黄尾鲴具有含肉率高、易捕捞、疾病少等特点，是水产养殖业中增养殖优质品种[2]。目前尚未见黄尾鲴疾病的相关报道，近年来，在湖南株洲地区某黄尾鲴苗种场养殖的黄尾鲴亲鱼大面积暴发溃疡综合征，严重影响亲鱼的繁殖与后期养殖。为探明株洲地区黄尾鲴溃疡综合征的病因，笔者采用传统病原菌分离鉴定方法和药敏纸片法，分离致病菌和筛选敏感的中草药和抗生素，并通过组织切片技术观察病理变化，以期为湖南株洲地区黄尾鲴溃疡综合征的防治提供基础数据和参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验鱼：患病黄尾鲴采集自湖南省株洲市醴陵县某黄尾鲴苗种场，体质量(240±20) g；健康黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)体质量(90±5) g，健康黄尾鲴体质量(150±5) g，均购自常德市龙港路菜市场。试验前于水族箱中暂养7 d，水温(28±1) ℃，充气，按体质量的2%投喂普通配合饲料。

主要试剂：肉汤培养基(LB)、肉汤琼脂培养基、脑心浸液培养基(BHI)和药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；细菌16S rDNA基因扩增通用引物合成和DNA测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；PCR试剂盒和DNA Marker为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；25种中草药(连翘、鱼腥草、穿心莲、苦参、白鲜皮、五味子、陈皮、黄芩、秦皮、艾叶、乌梅、牡丹皮、黄柏、紫苏叶、贯众、蒲公英、板蓝根、五倍子、马齿苋、柴胡、苏木、紫花地丁、黄连、金银花、野菊花)购自常德市九芝堂大药房；改良型苏木精—伊红染色试剂盒为Thermo公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离培养

取有典型症状的黄尾鲴亲鱼，用体积分数70%的酒精体表消毒后，无菌条件下，取肝脏、腹水及溃疡病灶等组织涂布接种脑心浸液琼脂平板，28 ℃恒温培养24 h，挑取优势菌落于肉汤琼脂平板划线纯化3次后，使用20%的甘油，-80 ℃保存备用。

1.2.2 人工感染试验

将纯化菌株接种于LB培养基，28 ℃，180 r/min振荡培养24 h，用无菌生理盐水稀释至1×107cfu/mL菌液备用。由于黄尾鲴生性急躁，加上实验室养殖条件不佳，实验室养殖难成活，因此选择较温和的小型鱼类黄颡鱼作为人工感染试验鱼[3]。将健康黄颡鱼随机分为4组，每组30尾，采用肌肉注射法，每尾黄颡鱼注射0.2 mL密度为1×107cfu/mL的菌液。试验组设3个平行，同时设生理盐水对照组。控制水温为(28±1) ℃，连续观察14 d，并记录患病症状和死亡情况，同时取濒死黄颡鱼内脏组织进行细菌再分离培养与鉴定，以确定致病菌。

1.2.3 病原菌鉴定

生理生化鉴定：生理生化鉴定采用Biolog全自动微生物分析系统进行鉴定，将分离的优势菌株划线接种于质量分数5% BUG的培养基上，28 ℃培养24 h，用无菌棉签蘸取一定量的细菌至IF-A接种液中，摇匀后调整浊度计读数为98%，以每孔150 μL加入到96孔GEN Ⅲ鉴定板中，于28 ℃培养24 h，用Biolog全自动微生物分析系统读取生理生化结果并进行鉴定。

16S rDNA鉴定：采用16S rDNA 的通用引物，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTC AG-3′，反向引物1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′[4]。反应体系：2×Taq PCR Mix 预混液25 μL，引物27F和1492R各1 μL，HZ0416菌液3 μL，ddH2O补齐至50 μL。扩增条件：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果进行BLAST比对分析，通过ClustalW 2.1和MEGA 7.0 软件采用邻接法构建系统发育树，自展法检测设置为1000次。

1.2.4 药物敏感性试验

抗生素药物敏感试验：采用常规纸片琼脂扩散法对常用8 种抗生素药物进行敏感性测定。取100 μL密度为1×107cfu/mL的优势菌株均匀涂布于肉汤琼脂平板，并将药敏纸片均匀布置于平板上，每个纸片之间的距离不小于2 cm，28 ℃培养24 h 后测定抑菌圈直径大小，并根据杭州微生物试剂有限公司公布的药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准判断药物敏感性。

中草药药物敏感试验：采用常规纸片琼脂扩散法对常用25种中草药进行敏感性测定。取2 g中草药浸泡于30 mL体积分数95%乙醇中，常温浸泡，每周摇匀晃动1次，浸泡100 d后，按每片药敏纸片(厚度0.5 mm、直径6 mm)10 μL药液加至灭菌后烘干的空白药敏纸片中，37 ℃ 烘干备用；对照药敏纸片按每片灭菌空白药敏纸片滴加10 μL体积分数95%乙醇后，37 ℃ 烘干。中草药敏感性试验操作方法同抗生素药敏试验，设置试验组和对照组，试验组在平板上均匀布置制备好的中草药药敏纸片，对照组布置对照药敏纸片。敏感性判断标准：抑菌圈直径≥20 mm为极度敏感，以“+++”表示；抑菌圈直径15～<20 mm为高度敏感，以“++”表示；抑菌圈直径10～<15 mm为中度敏感，以“+”表示；抑菌圈直径<10 mm为低度敏感或无抑制效果，以“-”表示[5-6]。

1.2.5 病理学观察

取患典型溃疡综合征的病鱼肝脏、脾脏、肾脏和病灶处肌肉等组织于体积分数10%甲醛溶液固定后，经体积分数30%～100%乙醇梯度脱水后，二甲苯透明，石蜡包埋，以4～5 μm厚度切片，苏木精—伊红染色后，使用徕卡(Leica)高级显微系统(DM3000)观察组织病理变化并拍照。

2 结果与分析

2.1 流行病特征及临床症状

黄尾鲴亲鱼溃疡综合征主要暴发于繁殖季节4月—6月初，水温25～28 ℃，发病率和死亡率高，消毒药物、杀虫类药物治疗效果不佳。患病黄尾鲴主要表现为：反应迟钝，独游；体表不同部位出现大面积溃疡，部分病鱼溃疡处深入内脏；鳍条充血、出血，并伴有烂尾现象。解剖可见：病鱼腹腔有淡黄色积液；肝脏充血、出血，严重者呈糜烂状；脾脏、肾脏红肿，肠道内无食物(图1)。

图1 黄尾鲴溃疡综合征临床症状Fig.1 Clinical symptoms of ulcerative disease syndrome in X. davidia.鱼体表面不同部位出现溃疡症状(▲.背鳍基部；△.腹部；→.尾柄处)，烂鳍； b.病灶溃疡深至内脏(▲)，肝脏充血(△)； c.肝脏糜烂(▲)，腹腔有淡黄色积液(△).a.typical ulcers are found in different parts of fish surface (▲.the ulcers in base of dorsal fin； △.in abdomen； →.in caudal peduncle) and fin rot; b.the ulcer is deep to the internal organ (▲), hyperemia and hemorrhage in liver (△); c.liver erosion (▲) and light yellow effusion in peritoneum (△).

2.2 优势菌株分离

从黄尾鲴亲鱼病灶处和肝脏中分离1株优势菌HZ0416，镜检为革兰氏阴性菌，呈短杆状。LB培养基28 ℃培养24 h菌落大小约2 mm，圆形，表面光滑，形态饱满，均质透明，呈乳白色或淡黄色。

2.3 人工感染试验

肌肉注射感染24 h后，黄颡鱼开始出现溃疡症状；感染后3 d，黄颡鱼开始出现死亡现象；14 d死亡率达86.7%(图2)。主要表现症状为：黄颡鱼不

图2 黄颡鱼感染HZ0416累积死亡率曲线Fig.2 The cumulative mortality of yellow catfish P. fulvidraco infected with HZ0416

同部位出现不同程度的溃烂(图3a～b)，腹腔有带血腹水，肝脏充血、出血(图3c)，胆囊肿大，部分鱼有肠充气现象。同时从病鱼的肝脏和病灶处也分离到菌株HZ0416，对照组黄颡鱼体表和内脏均无任何明显症状。

图3 黄颡鱼感染HZ0416菌株的临床症状Fig.3 Clinical symptoms of yellow catfish P. fulvidraco infected with strain HZ0416a、b.鱼体表面不同部位出现典型溃疡症状(▲.腹部;☆.臀鳍基部)； c.肝脏糜烂充血(▲)，腹腔有带血的腹水(☆).a,b.typical ulcers in different parts of fish surface (▲.the ulcers in abdomen; ☆.base of anal fin); c.hyperemia and erosion in liver (▲) and bloody ascites in peritoneum (☆).

2.4 优势菌株鉴定

2.4.1 Biolog微生物自动分析系统鉴定

Biolog微生物自动分析鉴定系统检测结果显示，分离的菌株HZ0416为舒氏气单胞菌(Aeromonasschubertii)，置信度高达81.7%，鉴定结果各评价参数为PROB=0.817，SIM=0.796，DIST=2.939。

2.4.2 16S rDNA鉴定

菌株HZ0416的16S rDNA测序获得1338 bp序列，GenBank登录号为MN239102。美国国立生物技术信息中心核酸序列BLAST同源性比对分析结果显示，菌株HZ0416和舒氏气单胞菌同源性最高，达99.4%。系统发育树结果显示，HZ0416菌株和舒氏气单胞菌聚为一支，而后与嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、维氏气单胞菌(A.veronii)聚为一簇，表明菌株HZ0416为舒氏气单胞菌(图4)。

图4 菌株HZ0416基于16S rRNA基因序列的系统进化树Fig.4 Phylogenic tree of strain HZ0416 based on 16S rRNA gene sequences

2.5 药敏试验

2.5.1 抗生素药物敏感性

抗生素药物敏感性试验结果见表1，舒氏气单胞菌HZ0416对庆大霉素和氟苯尼考高度敏感；对环丙沙星中度敏感；对卡那霉素、多黏菌素B、青霉素、克林霉素和妥布霉素具有耐药性。

表1 菌株HZ0416对抗生素药物敏感性试验结果Tab.1 Antibiotic susceptibility test of the strain HZ0416

2.5.2 中草药药物敏感性

中草药药敏试验结果显示，五倍子醇提取液对舒氏气单胞菌HZ0416的抑菌圈直径达30 mm，显示其对舒氏气单胞菌HZ0416极度抑制效果；陈皮、牡丹皮中草药醇提取液对舒氏气单胞菌HZ0416具有高度抑制效果；鱼腥草、穿心莲、蒲公英、柴胡、苦参中草药醇提取液对舒氏气单胞菌HZ0416有较好抑制效果；而舒氏气单胞菌HZ0416对白鲜皮、五味子、黄芩、乌梅、苏木、金银花、连翘、秦皮等17种中草药醇提取液呈低度敏感或不敏感(表2)。

表2 菌株HZ0416对中草药药物敏感性试验结果Tab.2 Herbal medicinal susceptibility test of the strain HZ0416

2.6 组织病理观察

组织病理学结果(图5)显示，肌纤维断裂、溶解，细胞堆积形成肉芽肿，大量炎症细胞浸润，同时病灶处细胞中可见细菌的团块和细菌感染后细胞凋亡留下的细胞轮廓(图5b)；脾脏实质性细胞空泡坏死，组织内有大量含铁血黄素沉着，伴随有炎性细胞浸润(图5d)；肝细胞肿胀，细胞多发生核固缩、破裂和溶解，细胞界限不清晰，并伴有充血、出血现象，组织内有大量含铁血黄素沉着(图5f)；肾小球囊壁细胞变性、坏死，上皮细胞增生，肾间质缩小，炎症细胞浸润(图5h)。

图5 黄尾鲴溃疡综合征病理组织学观察Fig.5 The pathohistological observation of ulcerative disease syndrome in X. davidia.正常肌肉组织； b.肌肉溃疡病灶处形成肉芽肿(▲)，肌纤维变性、坏死(★)，组织中可见细菌团块(△)，炎性细胞浸润(→)； c.正常脾脏组织； d.脾细胞有含铁血黄素沉积(★)，实质性细胞空泡坏死(▲)，大量淋巴细胞和单核吞噬细胞浸润(→)； e.正常肝脏组织； f.肝脏细胞肿胀，充血(▲)，有含铁血黄素沉积(★)； g.正常肾脏组织； h.肾小球囊壁细胞变性、坏死，上皮细胞增生(★)，炎症细胞浸润(→).a.normal tissue section diagram of muscle; b.the granuloma in lesion of muscle ulcer (▲), muscle fiber degeneration, and necrosis (★), bacterial clumps are found in lesion (△) and inflammatory cells infiltration (→); c. normal tissue section diagram of spleen; d.hemosiderin deposits in spleen cells (★), vacuolar degeneration in the spleen cells (▲) and lymphocytes and monocytes cells infiltration (→); e. normal tissue section diagram of liver; f.swell, hyperemia (▲) and hemosiderin deposition in liver cells (★); g. normal tissue section diagram of kidney; h.necrosis in cells of Bowman′s capsule wall, epithelial cells hyperplasia (★) and inflammatory cells infiltration (→).

3 讨 论

3.1 致病菌鉴定与分析

黄尾鲴具有易捕捞、抗病性强、生长快等特点，已成为当前水产养殖品种结构调整中首选的优良品种之一。目前尚未见黄尾鲴相关疾病的报道，笔者自患溃疡综合征的黄尾鲴亲鱼肝脏中分离到1株革兰氏阴性短杆菌HZ0416。人工感染试验结果显示，菌株HZ0416感染黄颡鱼表现的症状与黄尾鲴亲鱼自然发病症状相似，从濒死黄颡鱼肝脏中分离到相同病原菌，感染后死亡率高达86.7%，因而推测菌株HZ0416能引起黄颡鱼溃疡综合征，从而推断菌株HZ0416是湖南株洲苗种场黄尾鲴溃疡综合征的潜在病原菌。

目前报道的溃疡综合征病原菌主要为气单胞菌属中的杀鲑气单胞菌(A.salmonicide)[7]、维氏气单胞菌[8,9]、温和气单胞菌(A.sobria)[10]和豚鼠气单胞菌(A.caviae)[11]等。笔者自患病黄尾鲴中分离到菌株HZ0416，并证明其能诱发黄颡鱼溃疡综合征。进一步通过Biolog全自动微生物分析系统和16S rDNA序列分析，确定菌株HZ0416为舒氏气单胞菌。舒氏气单胞菌最早于1988年自人体脓肿、伤口等处分离，目前已是人—畜—鱼的重要条件致病菌[12]，其能引起人腹泻和患坏死性筋膜炎，并导致人体多器官功能衰竭而死亡[13-14]。舒氏气单胞菌广泛分布于淡、海水等环境中[15-16]，能引起乌鳢(Channaargus)[17-18]、淡红墨头鱼(Garrarufa)[19]、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[20]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[21]等发病致死，对水产养殖业危害较大。

3.2 发病原因分析

黄尾鲴溃疡综合征是株洲市近年来陆续发生的比较严重的传染性疾病，主要表现为：病鱼体表多处溃疡，肝脏、脾脏、肾脏等组织红肿，出血、充血。流行病学调查显示，该病主要发生在亲鱼繁殖季节，初春温度在22 ℃时开始发病，并出现零星死亡；当水温达到28 ℃，发病达到高峰期。推测在4—6月亲鱼繁殖过程中，由于黄尾鲴性急喜跳[3]，因而在捕捞和集中高密度养殖期间亲鱼容易损伤体表，加上过冬后鱼体免疫力低下，更容易使环境中普遍存在的舒氏气单胞菌在体表创伤处附着和定殖，引发感染。随着感染的加剧，舒氏气单胞菌随血液循环进入鱼体内脏器官，进而患溃疡综合征[22]。组织病理学观察结果显示，舒氏气单胞菌感染损伤鱼体肌肉后，肌纤维断裂、溶解，随着感染的加深，侵染机体肝脏、脾脏和肾脏，引起肝脏、脾脏和肾脏组织出血、充血，实质性细胞凋亡、坏死，导致多组织器官功能受损，引发死亡。

3.3 敏感性药物筛选

药敏试验结果显示，舒氏气单胞菌HZ0416对庆

大霉素、氟苯尼考和环丙沙星敏感；对卡那霉素、多黏菌素B、青霉素、克林霉素和妥布霉素具有耐药性，与自乌鳢[18]和杂交鳢(C.maculata×C.argus)[23]中分离的舒氏气单胞菌基本一致。另外，五倍子醇提取液对舒氏气单胞菌HZ0416的抑菌圈直径达30 mm，优于试验中所选抗生素的抑菌效果，同时试验结果显示，陈皮、牡丹皮、柴胡、鱼腥草、穿心莲等对舒氏气单胞菌HZ0416也具有较好的抑制效果。因此，五倍子可作为预防和治疗溃疡综合征的候选药物，替代抗生素的使用降低养殖环境中耐药菌的产生。

4 结 论

自患典型溃疡综合征的黄尾鲴中分离鉴定1株致病性舒氏气单胞菌，回归感染试验显示，其对黄颡鱼具有强致病性。黄尾鲴亲鱼溃疡综合征的发病原因可能是在拉网和繁殖过程中，鱼体产生机械损伤，从而感染环境中的舒氏气单胞菌，引起肝脏、脾脏和肾脏等实质性器官细胞凋亡、坏死，表现出功能障碍，最终死亡。氟苯尼考、五倍子等作为候选药物防治该养殖场黄尾鲴溃疡综合征，同时在亲鱼培育中，应注意提高鱼体免疫力，加强对该病的预防。