通关藤苷H抑制低分化鼻咽癌细胞增殖及转移的作用机制研究*

陈丽佳，张岩

（天津医科大学总医院药剂科，天津 300052）

鼻咽癌（NPC）是源于鼻咽上皮组织的恶性肿瘤，大多数为非角化性未分化癌，极易侵犯周边组织并经颈淋巴结转移扩散。NPC在欧洲、北美地区发病率较低，而高发于东南亚及中国南部，其中广东、广西等地区约占总发病例数的80%[1]。由于鼻咽癌发生的解剖学部位具有特殊性以及早期的颈淋巴结转移使手术切除难以进行，目前鼻咽癌的治疗以放疗为主并辅以化疗。鼻咽癌放疗后常出现头颈部器官组织放射性损伤，常规化疗药物环磷酰胺、顺铂、5-氟尿嘧啶等可导致多种严重不良反应[2]。因此，寻找安全有效治疗药物是临床急需解决的问题。天然植物的抗肿瘤活性化合物具有低毒高效的特点，现有多种中药材的提取物制备成现代药物制剂在临床上广泛使用[3]。消癌平注射液是疗效显著的抗肿瘤辅助药物之一，由萝藦科植物通关藤的提取物制备而成，适应症主要为食道癌、胃癌、肝癌[4]。研究表明甾体皂苷类化合物是通关藤的抗肿瘤活性成分之一，其中通关藤苷H可通过影响PI3K/Akt信号通路抑制消化系统肿瘤的生长和增殖[5-6]。目前，国内外未见有通关藤苷H在鼻咽癌方面的药效和药理研究报道，因此文章尝试以低分化CNE-2鼻咽癌细胞作为疾病模型，研究通关藤苷H对其增殖和侵袭的抑制作用，为阐明消癌平注射液的药理机制和扩大其适应症提供临床前的实验依据。

1 材料

1.1 药品与试剂 通关藤苷H（美国Sigma Aldrich公司），CCK-8试剂盒（日本Dojindo化工研究所）。RPMI1640培养基、特级胎牛血清、0.25%胰酶溶液（美国 Gibco公司），磷酸盐缓冲液（PBS）、AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、BCA法蛋白定量试剂盒、基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）酶联免疫疫吸附（Elisa）试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），胶原包被Transwell培养板（美国Corning公司），β 肌动蛋白（β-actin）、磷酸化蛋白激酶（p-Akt）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（p-GSK-3β）、周期蛋白-D1（Cyclin D1）、上皮性钙黏附蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏附蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等兔抗人一抗以及羊抗兔二抗均购于（美国Abcam公司）。

1.2 仪器 CellXpert C170i CO2细胞培养箱（德国Eppendorf公司），ALLEGRA X-15R台式离心机（美国Beckman公司），FACS Calibur型流式细胞仪（美国BD公司），Western blot转膜仪（美国Bio-rad公司），DMi8倒置显微镜（德国Leica公司），Statfax 4200酶标仪（美国Awareness公司）。

1.3 细胞 人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2 方法

2.1 细胞的培养 将CNE-2细胞接种于含10%胎牛血清（FBS），100 mg/L青霉素，100 mg/L硫酸链霉素的RPMI 1640培养基中，在37℃、饱和湿度、5%二氧化碳（CO2）、95%空气的细胞培养箱中培养。待细胞生长覆盖约至80%时，用0.25%胰酶消化传代，并按3×104cells/mL密度接种于培养板或培养瓶内备用。

2.2 细胞存活率的检测 将CNE-2细胞接种于96 孔板中，分别加入终浓度为 10、20、40、60、80、100 μmol/L的通关藤苷H，对照组不添加药物，每组设6个复孔，各组作用24 h后，弃去旧培养液，PBS洗涤两3次后加入新鲜培养液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃温育2 h后，测定各组吸光度（A值）。所得A值按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率%=通关藤苷H组A450值/对照细胞组A450值×100%。

2.3 细胞凋亡率的检测 将CNE-2细胞接种于6孔板中，药物处理24 h后，弃去培养液后以PBS小心洗涤2次，加入用0.25%胰酶[不含乙二胺四乙酸（EDTA）]于37℃进行消化，收集细胞悬液，以1 000 r/min，离心半径 10 cm，离心 10 min，弃去上清，收集细胞后按照试剂盒提供的步骤进行AnnexinVFITC/PI染色，以流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.4 细胞转移和侵袭力的检测 将对数生长期的CNE-2细胞10 cm接种于培养皿中。把Transwell小室架于Transwell 24孔板上，按1∶7比例将50 mg/L Matrigel胶与无血清DMEM培养液混合均匀，取100 μL加至小室中央，置于37℃培养箱中孵育6 h，然后弃去残余液体。将细胞按2×105/孔接种至Transwell小室内，下小室加入800 μL含10%胎牛血清DMEM培养液。CNE-2细胞在Transwell小室培养24 h后，加入不同浓度通关藤苷H处理24 h，弃去培养液，无水乙醇固定细胞10 min，0.1%结晶紫染色30 min，洗涤后在显微镜下观察，随机统计中间和四周5个视野细胞数的平均值和标准差。

2.5 蛋白表达量的检测 将在6孔板中培养好的CNE-2细胞用PBS冲洗2次，加入预冷细胞裂解液作用 30 min，12 000 r/min，离心半径 10 cm，在 4 ℃下离心15 min，沉淀细胞碎片等杂质，取上清液，BCA法测定蛋白量。用含12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%BSA封闭90 min，加入稀释好的一抗，在4℃条件下孵育过夜。洗膜后，加入二抗，37℃孵育1 h，洗涤2次，采用凝胶成像系统软件分析胶片中蛋白条带组的灰度面积，以内参β-actin基准计算各待测蛋白的相对表达量。

2.6 MMP-2和MMP-9分泌量的检测 将CNE-2细胞接种于6孔板中，细胞生达到80%～90%时，加入以无血清培养基溶解的药物处理24 h后，吸取上清液，3 000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min去除细胞残屑，按试剂盒说明书操作检测MMP-2和MMP-9含量，以对照组为基准，比较各药物组细胞培养液中MMP-2和MMP-9的相对分泌量。

2.7 统计学方法 利用SPSS 24.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，两独立分组间比较采用t检验，组间两两比较采用SNK检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用SNK检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 通关藤苷H对CNE-2细胞存活率的影响 与对照组相比，当通关藤苷H浓度高于20 μmol/L时，CNE-2细胞的存活率随浓度增加而逐渐降低，各组差异均具有统计学意义（P<0.05），当浓度为80μmol/L时，通关藤苷H对细胞的抑制作用与60 μmol/L浓度组相比，并无明显提高，而当浓度达到100 μmol/L时细胞的存活率又出现下降。出现此结果的原因可能是当通关藤苷H浓度为60～80 μmol/L范围时，细胞对药物浓度的增加敏感性不高，药物对细胞的抑制作用已达到平台期，而当浓度为100 μmol/L时，很可能药物浓度偏高而使培养环境的理化因素出现明显改变，致使细胞出现非药理作用的坏死。因此，在后续实验中，按 20、40、60 μmol/L 设 3 个浓度组进行研究较为适合。见表1。

表1 不同剂量通关藤苷H对CNE-2细胞存活率的影响Tab.1 Effect of different doses of tenacissoside H on survival rate of CNE-2 Cells

3.2 通关藤苷H对CNE-2细胞凋亡率的影响 运用流式细胞仪检查细胞的凋亡损伤情况，对凋亡细胞定量分析，细胞凋亡率为右上区与右下区细胞所占比例之和。对照组细胞凋亡率为4.8%，与之相比药物组细胞凋亡率随通关藤苷H浓度提高而增加，20、40、60 μmol/L 3 个浓度组细胞凋亡率依次为（24.0±3.8）%、（52.6±5.3）%、（68.4±5.8）%，各组差异均具有统计学意义（P<0.05）。结果表明通关藤苷H可促进CNE-2细胞的凋亡。见图1。

图1 不同剂量通关藤苷H对CNE-2细胞凋亡率的影响Fig.1 Effects of different doses of tenacissoside H on the apoptotic rate of CNE-2 cells

3.3 通关藤苷H对CNE-2细胞转移侵袭能力的影响 镜下细胞数量结果如图2所示，与对照组CNE-2细胞比较，随着通关藤苷H浓度的增加，CNE-2细胞侵蚀基质蛋白转移至下室的数量逐渐减少，图3所示为采用目镜微尺的细胞计数的结果，各药物组与对照组的细胞数量差异均具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。

图2 Transwell下室细胞染色显微镜观察结果（×200）Fig.2 Microscopic observation of Transwell’s inferior ventricular cells(×200)

图3 Transwell下室细胞染色显微镜观察细胞数（×200）Fig.3 Microscopic observation of Transwell’s inferior ventricular cells(×200)

3.4 通关藤苷H对p-Akt/p-GSK-3β/Cyclin D1通路的影响 蛋白免疫印迹（WB）的显影条带如图4A所示，与对照组相比，随着通关藤苷H浓度的递增，CNE-2细胞中p-Akt的含量逐渐下降而p-GSK-3β的含量逐渐增加，同时Cyclin D1的相对表达量相应下调。图4B所示为根据WB条带的灰度值换算成蛋白相对含量的百分比，经统计分析，各药物组与对照组蛋白含量的差异均具有统计学意义（P<0.05）。

图4 不同剂量通关藤苷H对p-Akt/p-GSK-3β/Cyclin D1通路的影响Fig.4 Effect of different doses of tenacissoside H on p-Akt/p-GSK-3β/Cyclin D1 pathway

3.5 通关藤苷H对CNE-2细胞转移侵袭蛋白含量的影响 WB的显影条带如图5A所示，与对照组CNE-2细胞比较，通关藤苷H可随浓度递增而逐渐上调E-cadherin和下调N-cadhexin、Vimentin的含量。图5B所示为根据WB条带的灰度值换算成蛋白相对含量的百分比，经统计分析各药物组与对照组的蛋白含量差异均具有统计学意义（P<0.05）。

图5 不同剂量通关藤苷H对CNE-2细胞转移侵袭蛋白含量的影响Fig.5 Effect of different doses of tenacissoside H on the content of metastasis and invasion protein of CNE-2 cells

3.6 MMP-2和MMP-9分泌量的检测 Elisa检测结果如图6所示，与对照组比较，3个药物组培养液中MMP-2和MMP-9的相对含量随通关藤苷H浓度增加而逐渐减少，各药物组与对照组的差异均具有统计学意义（P<0.05）。

图6 不同剂量通关藤苷H对MMP-2和MMP-9分泌量影响Fig.6 Effect of different doses of tenacissoside H on MMP-2 and MMP-9 secretion

4 讨论

NPC发病初期并无特征性症状，易与其他鼻咽疾病混淆，且发病早期可出现浸润生长，不少初诊患者即伴有颈淋巴结转移及远处转移，这是鼻咽癌治疗欠佳的主要原因[7-8]。鼻咽癌细胞的恶性程度和侵袭转移能力与其分化程度密切相关，分化程度越低，增殖、侵袭、转移能力也相对较强，患者的预后情况也越不理想[9]，开发能够有效抑制低分化鼻咽癌的药物是目前研究重点之一，因此本文使用低分化鼻咽癌细胞株CNE-2作为研究对筛选有效药物的对象具有的实际参考意义。

肿瘤细胞的存活、增殖、侵袭、转移涉及到多种细胞信号通路[10-11]，包括 Traf6/TAK1、Wnt/β-catenin、Akt、GSK-3β、Cyclin D1 等，其中 Akt/GSK-3β/Cyclin D1通路与肿瘤细胞的快速增殖有着密切联系。Akt对下游通路蛋白GSK-3β具有反向的调控作用，Akt经过第二信使PI3K磷酸化激活后，可抑制其下游的通路蛋白GSK-3β的磷酸化修饰，从而促进细胞增殖生长。GSK-3β属于丝氨酸/苏氨酸类激酶，在磷酸化生成p-GSK-3β之前，GSK-3β可延长下游的信号通路蛋白Cyclin D1的半衰期，促使细胞增殖加快乃至发生癌变恶化[10-11]。Cyclin D1是细胞周期蛋白的中最重要的一员，其过度上调表达可使细胞增殖失控，迅速从G1期进入S期，从而促进细胞的存活、生长、转移和代谢[12]。据此，本文选择检测Akt/GSK-3β/Cyclin D1的信号通路考察通关藤苷H对CNE-2细胞增殖与凋亡的影响。实验结果显示，通关藤苷H通过抑制Akt的磷酸化激活，加强GSK-3β对Cyclin D1的抑制作用，遏制细胞周期的进展，最终抑制CNE-2细胞的生长和增殖[13]。

上皮-间质转化（EMT）是上皮源性肿瘤发生转移的首要阶段，主要发生机制为不同亚型钙黏附蛋白（Cadherin）之间的转换[14]。其中E-cadherin是维持上皮细胞之间的连接黏附，保持细胞聚集功能的主要分子，因而在正常细胞组织中保持高水平表达，若其表达水平降低，则可导致细胞复合体解离；而Cadherin另一个亚型N-cadherin的作用则与之相反，其在某些生长因子的作用下可使细胞复合体解离，在肿瘤细胞侵袭、浸润、转移的过程中起到促进作用[15-16]。波形蛋白（Vimentin）是中间丝蛋白家族的主要成员，其多聚体是与肌动蛋白和微管蛋白共同构成细胞骨架蛋白的关键成分，研究发现在癌细胞侵袭和迁移的过程中，游离Vimentin含量的不断增加，意味着细胞骨架蛋白发生解离，是EMT开始进展的信号[17]。本文实验结果表明，通关藤苷H可以抑制E-cadherin向N-cadherin的转化，并维持Vimentin多聚体的结构稳定，从而抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移[18]。

大量临床研究表明鼻咽癌的转移与MMPs的过度表达分泌密切相关，包括 MMP-1、2、7、9、13、14等众多家族成员，涉及细胞间质、基底膜胶原蛋白的降解以及骨质的侵蚀[19-20]。在各种MMPs成员中MMP-2和MMP-9与肿瘤发生侵袭转移的关系最为密切，MMP-2和MMP-9主要降解的底物为IV型胶原、明胶、弹力蛋白等组织基底膜的主要成分，而基底膜的降解是肿瘤细胞进行侵袭与转移首要阶段[21]。因此本文选用MMP-2和MMP-9作为检测指标，并选用富含层粘连蛋白、Ⅳ型胶原的Matrigel胶作为Transwell实验培养皿的基质进行研究。本文实验表明，随着通关藤苷H的浓度增加，CNE-2细胞培养基中的MMP-2和MMP-9含量逐渐减少，结合Transwell实验结果分析，可推断通关藤苷H能够抑制CNE-2细胞分泌MMP-2和MMP-9降低其侵袭转移的能力。

目前，大多数转移性鼻咽癌患者确诊后均需接受放疗和化疗，其营养状态、骨髓功能及心理承受能力均随病情的发展和药物不良反应的增加而逐渐下降，再次接受治疗预后欠佳。采用有效低毒的药物进行维持治疗，以提高生存质量为目标，尽可能延长生存时间，已成为治疗转移性鼻咽癌一种可行的方案。天然植物抗肿瘤药物具有低毒高效的优点，本实验研究表明消癌平注射液中的通关藤苷H对于低分化鼻咽癌细胞的增殖和侵袭转移均具有抑制作用，进一步明确消癌平注射液可应用于治疗鼻咽癌，而其有效成分通关藤苷H可研制成单一成分的抗癌药物，相对于消癌平注射液或通关藤总苷等复方药物，通关藤苷H的单成分制剂更有利于临床应用上调整药物的剂量和降低不良反应，为鼻咽癌患者提供更好的治疗方案。