体外脂肪变L02细胞Notch家族和脂质代谢变化研究*

吴伟杰，陈源文，丁雯瑾，范建高

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病机制尚不清楚，目前学界最为公认的发病机制为“多重打击学说”，NAFLD发生发展与炎症，氧化应激和胰岛素抵抗等代谢障碍关系密切，而其中肝细胞内甘油三酯异常沉积便是NAFLD发病过程中的关键一环[1]。Notch信号通路是通过相邻细胞之间配受体结合后释放Notch受体胞内结构域(Notch intracellular domain， NICD)进入胞核，激活下游转录因子Hes-1和Hey-1，转录因子结合到靶基因DNA序列上发挥作用[2-4]。研究发现人类肝组织Notch下游转录因子活性与NAFLD活动评分(NAS)呈正相关。同时，Notch信号通路能够激活肝组织对营养敏感的mTorc1通路，增加脂肪从头合成途径和肝脏甘油三酯的生成[5、6]。本实验通过建立体外脂肪变细胞模型并使用Notch信号通路抑制剂观察了L02细胞Notch1、-2、-3、Hes-1和Hey-1基因水平及其与脂质水平的变化，以探讨Notch家族对脂肪变细胞脂质代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器人 正常肝细胞L02由中国科学院上海细胞库提供；RPMI-1640 培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)均购于美国Hyclone 公司；胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)购于以色列Biological Industries 公司；γ分泌酶抑制剂N-【N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alnyl】-S-phenylycine t-butyl ester(DAPT)和棕榈酸(palmitic acid，PA)均购于美国默克公司；RPS-18内参引物购于中国上海生物工程公司；Trizol试剂和预混型定量用逆转录试剂盒购于日本宝日医公司；qPCR SYBR Green Master Mix购于中国上海翊圣生物科技有限公司；Q3 PCR 扩增仪和Nano Drop 2000 超微量分光光度仪(美国赛默飞公司)；PCR 逆转录仪(德国艾本德公司)；chemray240全自动生化分析仪(中国雷杜公司)。

1.2 体外细胞脂肪变模型建立与药物干预 使用PA 5mM母液和RPMI-1640完全培养基(含10% FBS)配制成含PA 0.1mM、0.25mM和0.5mM的完全培养基作为工作液使用。细胞造模分组：对照组(Con)、PA 0.1mM组、PA 0.25mM组和PA 0.5mM组，待L02细胞在培养皿中密度达到60%～70%时，弃掉原有的培养基，用PBS洗1遍，加入不同浓度的PA工作液处理L02细胞24 h，收集细胞。根据前期实验结果选择PA 0.25mM浓度作为造模条件，在PA 0.25 mM浓度下，将DAPT设为0 μM、1μM、2μM、5μM和10μM的干预浓度，其中以DAPT 0μM作为模型组，处理L02细胞24 h，收集细胞。

1.3 细胞Notch家族mRNA水平检测 采用Trizol提取细胞总RNA，使用预混型定量用逆转录试剂盒逆转录mRNA。在Primer bank设计引物，由上海生物工程公司合成。使用Q3 PCR扩增仪进行扩增，采用SYBR法，反应条件设定为反应体系20 μL，95 ℃预变性30 s，循环次数40次，依次进行95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s。Notch1上游：5’TGCGAGACCAACATCAACGAGTG3’，Notch1下游：5’TCAGGCAGAAGCAGAGGTAGGC3’，扩增片段长度为94 bp；Notch2上游：5’GTAAGGAGTGCCAATGGACGGATG3’，Notch2下游：5’ATTTCTGCCCTGTGAAGCCTGTG3’，扩增片段长度为120 bp；Notch3上游：5’CGTGGCTACACTGGACCTC3’，Notch3下游：5’AGATACAGGTGAACTGGCCTAT3’，扩增片段长度为109 bp；Hes-1上游：5’TCAACACGACACCGGATAAAC3’，Hes-1下游：5’GCCGCGAGCTATCTTTCTTCA3’，扩增片段长度为153 bp；Hey-1上游：5’GT-TCGGCTCTAGGTTCCATGT3’，Hey-1下游：5’CGTCGGCGCTTCTCAATTATTC3’，扩增片段长度为88 bp；选择人RPS-18作为内参对照，计算各基因mRNA相对水平(结果以2-ΔΔCt表示)。

1.4 培养上清液转氨酶检测 收集细胞上清液，准备谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)/谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)的基质液、显色液，应用终止液(浓缩终止液：双蒸水=1：9)，吸取待测样品50 μL，与基质液250 μL混合，37 ℃水浴30 min；加入显色液250 μL，37 ℃水浴20 min；加入应用终止液2.5 mL，混匀后室温放置5 min，在505 nm波长测得各管OD值。查询标准曲线，求得相应的水平。

1.5 培养上清脂质检测 收集细胞，离心弃净上清，用PBS洗两次，加入PBS 100 μL，重悬，超声破碎细胞，离心取上层上清，使用Chemray240全自动生化分析仪检测甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(cholesterol，TC)、游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)水平。

2 结果

2.1 不同浓度PA干预细胞Notch家族mRNA水平比较 与对照组比，在0.1mM PA干预下，Notch3 mRNA水平显著升高(P<0.05)；在PA 0.25mM浓度干预下，Notch3 mRNA水平显著降低(P<0.01)，而Hes-1 mRNA水平显著升高(P<0.01)；在0.5mM PA干预下，Notch3 mRNA水平显著降低(P<0.01)，而Notch1和Hes-1 mRNA水平显著升高(P<0.01)，Hey-1 mRNA水平变化与对照组比无统计学差异(P>0.05，表1)。

表1 不同浓度PA干预细胞Notch家族mRNA水平比较

2.2 不同浓度DAPT干预PA处理细胞Notch家族mRNA水平变化 与模型组(DAPT 0μM)处理相比，DAPT 2μM、5μM和10μM干预组Notch家族下游Hes-1和Hey-1 mRNA水平均显著下调(P<0.01)，而Notch1-3基因水平均未被DAPT显著抑制(表2)。

表2 不同浓度DAPT干预PA处理细胞Notch家族mRNA水平比较

2.3 各组细胞上清液转氨酶水平变化 在0.25mM和0.5mM PA处理组，AST水平显著高于对组【(6.7±2.6 )U/L和(12.4±1.6 )U/L对(2.4±0.1 )U/L，P均<0.01】；同样地，ALT水平也显著高于对照组【(5.7±0.8)U/L和(10.3±0.7)U/L对(2.2±0.3 )U/L，P均<0.01】；在0.25mM PA处理细胞，给予1μM、2μM、5μM和10μM DAPT干预24 h，各组AST水平均显著低于模型组(P均<0.01】，而ALT水平均无显著变化。

2.4 细胞TG、TC和FFA水平变化 在0.25mM和0.5mM PA处理组，细胞TG水平显著高于对照组【分别为(0.4±0.04)mmol/g和(0.4±0.04)mmol/g对(0.2±0.02)mmol/g，P均<0.01】；在 0.5mM PA处理组，细胞TC和FFA水平显著高于对照组【分别为(1.2±0.4)mmol/g对(0.2±0.02)mmol/g和(0.07±0.004)mmol/g对(0.02±0.001)mmol/g，P均<0.01】；在 0.25mM PA处理细胞，经2μM、5μM和10μM DAPT 干预24 h，细胞TG水平显著低于0μM DAPT处理模型组【分别为(0.03±0.01)mmol/g、(0.04±0.01)mmol/g和(0.02±0.01)mmol/g对(0.07±0.01)mmol/g，P均<0.01】，在10μM DAPT干预组，细胞TC水平显著高于模型组【(0.2±0.03)mmol/g对(0.1±0.02)mmol/g，P<0.05】，而FFA水平无显著变化。

3 讨论

本实验发现经PA处理L02细胞，Notch 1、Notch3及其下游Hes-1基因水平发生很大变化。据文献报道，Notch1和叉头框转录因子O亚型1(FoxO1)可以协同调节肝脏葡萄糖代谢，抑制Notch1和FoxO1基因表达能改善胰岛素抵抗小鼠对胰岛素的敏感性[7-11]。Notch家族与NAFLD脂代谢变化机制可能部分是通过胰岛素信号通路途径实现的[12]。本实验还发现经PA处理细胞Hes-1基因明显被激活。本实验使用DAPT作为γ-分泌酶底物，可以竞争性与γ分泌酶结合，从而实现间接抑制Notch信号转导。在PA作用细胞，经DAPT干预，观察到Notch下游Hes-1和Hey-1基因水平均被显著抑制，结果提示DAPT能成功阻断Notch向下游传导[13-15]。

有研究发现抑制脂肪肝大鼠Notch1能同时降低下游Hes-1表达，使脂质代谢相关基因、脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶表达下调，从而减轻大鼠脂肪肝和高血糖的发生发展[16-18]。Hes-1可以通过调节某种基因，有效阻断低密度脂蛋白受体在细胞膜上表达[19,20]。在实验中，我们通过抑制Notch通路，导致下游Hes-1和Hey-1基因表达下调，检测发现细胞内甘油三酯沉积减少。本研究表明，Notch在肝细胞脂质代谢过程中具有调节作用，其中Notch1/Hes-1途径可能是参与脂肪肝发病的潜在机制。因此，Notch信号通路值得进一步探索，是治疗肝脂肪变性有希望的靶点之一。

Notch信号依赖于细胞间配体与受体相互识别而发挥作用。肝脏组织内不仅有肝实质细胞，同时也存在肝星状细胞、库普弗细胞和血管内皮细胞等。单纯在L02细胞的实验可能不足以解释生物体内细胞间的相互作用。我们课题组拟在未来开展动物实验进一步了解Notch信号具体是如何影响肝脏脂代谢变化的，以期对肝细胞脂肪变性的发生机制有新的认知。