基于组学的板栗栗蓬与栗壳主要成分分析

范斯然，范佳佳，刘 阳，张 卿，邢 宇，秦 岭

(北京农学院植物科学技术学院，北京 102206)

板栗(CastaneamollissimaBl.)是壳斗科栗属植物中四大经济栽培物种之一。板栗富含多种维生素和矿物质，是典型的食药同源植物[1]。板栗果实由栗蓬、栗壳和栗仁种子组成，栗仁仅占果实总质量的35%～40%[2]，利用过程中产生大量栗蓬、栗壳等废弃物，已成为产业中亟待处理和解决的难点。

因为传统化学手段仅能在栗蓬和栗壳中分离或鉴别几种次生代谢物[3-4]，所以其中次生代谢物的种类了解的还不全面，造成了栗蓬、栗壳等废弃物利用还仅限于粗提取或仅单一产物纯化提取的现状[5-8]。吴云龙等[9]从板栗栗蓬中分离出2种化合物。赵德义等[10]发现栗壳中的次生代谢物包括酚类、黄酮等6类。随着组学技术的相继发展，使更深入研究板栗果实次生代谢物的组成成为可能[11]。

本研究以花后成熟板栗栗蓬和栗壳2种组织为研究材料，利用次生代谢组学方法，分析板栗栗蓬和栗壳的次生代谢物种类及其差异，挖掘其有利用价值的次生代谢物，为板栗加工产业废弃物资源化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集和提取方法

以北京怀柔板栗站十五年生‘燕山红栗’为试材，选取树势一致、无病虫害，结果正常的果实共30个。采集花后96 d成熟的栗蓬(Bur，BU)和栗壳(Shell，SH)。每种样品共3个生物学重复。样品经冷冻干燥后取100 mg粉末，用70%甲醇水溶液溶解过夜，充分震荡3次。10 000 g，10 min离心并吸取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤后存放于进样瓶中备用。

1.2 质谱采集与分析

质谱条件参照迈维(武汉)生物技术有限公司提供的代谢组检测质谱参数，并进行优化[12]。

1.3 质控样本

利用样本提取物混合制备质控样本，在检测分析的过程中每10个样本插入一个质控样本用以检测试验的技术重复性。

1.4 数据分析方法

采用多元统计分析，利用变量的重要性投影(variable importance in project，VIP)结合。并依靠KEGG数据库对差异次生代谢物进行注释和通路分类。

1.5 代谢组总成分分析方法

利用软件Analyst 1.6.3、混样质控QC样本的总离子流图本地代谢数据库、三重四级杆和MultiaQuant软件MRM代谢物检测多峰图对检测到的次生代谢物进行定性定量分析。

1.6 不同组织内代谢组学差异分析方法

1.6.1 主成分分析 对2种组织的样本进行主成分分析，结果见图1。共得到5个主成分，主成分1的贡献率为78.91%。2种组织样本在主成分分析图上分离趋势明显。

1.6.2 正交偏最小二乘判别分析 根据正交偏最小二乘判别分析模型分析次生代谢组数据，建立分析模型(图2)。模型验证中，原始模型的R2和Q2均大于R2’和Q2’，模型有意义，根据VIP值分析筛选其差异代谢物。

2 结果与分析

2.1 板栗栗蓬和栗壳次生代谢物

通过对栗蓬和栗壳试验样本分析，共检测到364种次生代谢物(表1)，其中酚酸类91种、黄酮121种、木脂素和香豆素23种、鞣质39种、生物碱24种、萜类20种、其他类的次生代谢物46种。不同质控样本的质谱表现一致，试验重复性良好。

表1 栗蓬和栗壳中次生代谢物种类Tab.1 Statistical table of secondary metabolites in chestnut bur and chestnut shell

2.2 次生代谢物的差异性筛选与分析

2.2.1 次生代谢物成分筛选与分析 为了分析栗蓬与栗壳次生代谢物相对含量的差异，本研究原始数据中的差异倍数进行以2为底的对数处理，这里仅列差异最大的10种次生代谢物(表2)。

表2 栗蓬和栗壳差异最大的前10种次生代谢物Tab.2 Ten secondary metabolites with the greatest difference in content between chestnut bur and chestnut shell

基于对检测到的次生代谢物的定量与定性分析，根据差异倍数的Log2FC≥1或Log2FC≤-1，且VIP值≥1，初步筛选出组织间差异的次生代谢物133种。其中酚酸类34种、黄酮57种、鞣质26种、木脂素和香豆素7种、生物碱3种、萜类1种、其他类5种，占次生代谢物的36.54%。

2.2.2 差异次生代谢物通路分析 差异次生代谢物通路分析见图3。根据差异次生代谢物结果，利用KEGG对通路进行富集结果分析，点所在的横坐标Rich factor值越大，则表示差异次生代谢物在对应通路中的个数与次生代谢组中注释到的该通路物质的个数的比值越大。P-value值越小，则表示对应通路富集越显著。图中的点越大，则代表富集到的差异次生代谢物个数越多。

栗蓬和栗壳差异次生代谢物通过KEGG数据库通路富集，共查询到26个差异次生代谢物，其中差异次生代谢物富集最多的通路是(1)黄酮类生物合成途径：包括白杨素、柚皮素等14种成分，(2)黄酮和黄酮醇的生物合成途径：包括金合欢素、山柰酚等14种成分，(3)花色苷生物合成途径：包括天竺葵素 3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷等4种成分。

3 讨 论

本研究采用次生代谢组学技术，以成熟板栗的栗蓬、栗壳为材料，对次生代谢物进行组学定性定量检测与分析，从全部材料中共检测到364种次生代谢物，差异次生代谢物133种占次生代谢物的36.54%。

栗蓬相对于栗壳的次生代谢组中，上调的成分集中在鞣质与酚酸类，典型的如鞣花酸、没食子酸和单宁的衍生物等。而栗壳相对于栗蓬，其上调成分则集中在黄酮类物质与原花青素A1上。特别是原花青素A1为栗壳特有，差异倍数的对数高达18.08。这些次生代谢物分类与含量上的差异是栗蓬与栗壳在次生代谢组上最根本的区别。

栗蓬和栗壳次生代谢组中，各有41种和20种特有次生代谢物，二者共占次生代谢物364种的23.10%。对相关文献进行检索，共有14种次生代谢物有相关报道，大部分具有药用价值[13]。其中典型的为抗氧化的山柰酚[14]和有抗癌作用的6-甲基香豆素等[15]。本研究对检测到的板栗果实栗蓬和栗壳组织中次生代谢物进行了初步分析比较，为下一步板栗资源的加工和利用提供了参考。