高效液相色谱技术联合红细胞参数在血红蛋白病筛查中的应用

王也飞，吴蓓颖，夏文权，陈 宁，胡翊群

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验系，上海 200025；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025；3.上海交通大学医学院，上海 200025）

血红蛋白（hemoglobin,Hb）病是由于珠蛋白基因突变或缺如引起的单基因遗传病，可分为两大类，其中一类是由于珠蛋白基因的缺陷使Hb 中的一种或几种珠蛋白肽链合成减少或不能合成，导致Hb 组分改变，称为珠蛋白生成障碍性贫血（又称地中海贫血，简称地贫）。迄今为止，世界范围内约有1.5%的人群（8 000 万～9 000 万人）携带β-珠蛋白生成障碍性贫血基因。20 世纪80年代，我国20 个省、市、自治区共60 万人的Hb 病调查结果显示，β-珠蛋白生成障碍性贫血的患病率约为0.67%[1]。另一类Hb 病是由于珠蛋白基因变异导致其分子结构异常，形成Hb 变异体，故称为异常Hb 病。在我国广东、广西和海南等地，异常Hb 病突变基因的人群携带率较高，为0.285%～0.479%[2]。

目前，基因检测仍是诊断Hb 病最可靠的方法，但其方法繁琐，且常规的珠蛋白生成障碍性贫血基因筛查无法检出少见类型的Hb 变异体。随着全自动血红蛋白分析仪的问世，在我国尤其是两广地区已开始将高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）技术应用于珠蛋白生成障碍性贫血的筛查。上海地区并非珠蛋白生成障碍性贫血或异常Hb 病的高发地区，但随着人口流动，近年来由本实验室确诊的病例数呈逐年增多趋势。作为本地区标本量最大、最早采用HPLC 法进行Hb 病筛查的实验室，本研究应用HPLC 检测联合红细胞参数测定，对1 029 例筛查样本进行分析，同时与基因检测结果进行比较，旨在探讨HPLC检测和红细胞参数分析在上海地区Hb 病筛查中的实际应用价值，分析结果总结如下。

资料与方法

一、资料

收集2014年11 月至2018年12 月期间，至上海交通大学医学院附属瑞金医院门诊就诊及住院进一步诊治的疑似Hb 病患者（伴有小细胞低色素性贫血、黄疸或脾肿大等症状者）或存在进行溶血性贫血的患者，共1 029 例，其中女性700 例，男性329 例，年龄为1 个月～95 岁。

二、方法

1.红细胞参数测定及血涂片检查红细胞形态：所有研究对象均抽取静脉血，其中2 mL 置于乙二胺四乙酸二钾抗凝管内。采用希森美康XE-2100 全自动血细胞分析仪及配套试剂测定红细胞参数，包括红细胞计数、Hb、平均红细胞体积（mean corpuscular volume,MCV）、平均红细胞血红蛋白量（mean corpuscular hemoglobin,MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobin contentration MCHC）等。

2.HPLC 法Hb 分析：取2 mL 静脉血置于乙二胺四乙酸二钾抗凝管中，采用美国伯乐公司VARIANT Ⅱ高效液相色谱分析仪及配套试剂进行检测，运行程序为β-珠蛋白生成障碍性贫血短程序，运行约6.5 min 后，由仪器自动分析定量计算全血中Hb 各成分，并显示出图谱和结果。对于贫血严重的标本，取5 μL 全血，用1 mL 溶血缓冲液稀释后再上机分析。根据各Hb 变异体的滞留时间，将HPLC 系统的出峰图形依次分为P1窗、F窗、P2窗、P3窗、A0窗、A2窗、D窗、S窗和C窗，结合Hb 变异体在HPLC 检测中的滞留时间、在总Hb 中的百分含量及色谱图形特征对其进行鉴定。

3.珠蛋白生成障碍性贫血基因分析：采用聚合酶链反应和反向斑点杂交技术检测17 种国人常见的β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变和非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血的3 种基因突变（αCSα、αQSα、αWSα）；采用缺口聚合酶链反应法结合琼脂糖凝胶电泳技术检测3 种缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血（--SEA、-α3.7、-α4.2），以上统称为“常见珠蛋白生成障碍性贫血基因”。对HPLC 检测出现异常峰谱，而常见珠蛋白生成障碍性贫血基因检测呈阴性者，采用DNA 测序技术对α-珠蛋白和β-珠蛋白基因外显子进行序列分析。所用试剂盒均购自亚能生物技术（深圳）有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作、质量控制及结果判断。根据检测结果，将常见珠蛋白生成障碍性贫血基因和DNA 测序均未发现异常者作为基因检测阴性组，出现异常则作为基因检测阳性组。

4.判断标准：Hb 病筛查中，患者血样本中血红 蛋 白A2（hemoglobin A2,HbA2）降 低（<2.5%）和（或）出现快速区带时判断为α-珠蛋白生成障碍性贫血，HbA2和血红蛋白F（hemoglobin F,HbF）1 项或2 项均增高（参考值范围HbA22.5%～3.5%，HbF<1.5%）时判断为β-珠蛋白生成障碍性贫血。

5.统计学处理：数据采用SPSS 21.0 软件和MedCalc 软件进处理分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。绘制受试者操作特征曲线，确定HbA2及红细胞参数筛查Hb 病的临界值。

结果

一、珠蛋白基因检测结果

1 029 例患者经基因检测，有591 例（57.43%）被确诊为珠蛋白生成障碍性贫血，14 例（1.36%）被确诊为异常Hb 病，2 例发现了单纯β 珠蛋白基因（HBB）c.9T>C 组氨酸同义突变（未导致Hb 变异体的形成）。本研究中患者以β-珠蛋白生成障碍性贫血最多见(403/1 029,39.16%)，珠蛋白基因分析结果分布情况见图1。本研究共检测出19 种β-珠蛋白生成障碍性贫血基因型，其中以β654/βN 最多见(168/1 029,16.33%)；共检测出10 种α-珠蛋白生成障碍性贫血基因型，其中以--SEA/αα 最常见(119/1 029,11.56%)。不同Hb 病的HbA2和HbF 检测值范围见表1，各类珠蛋白生成障碍性贫血基因型构成比见图2。

图2 各基因型构成比

表1 1 029 例珠蛋白基因分析结果及HbA2 和HbF 检测值范围

图1 珠蛋白基因分析结果分布

二、红细胞参数测定、血涂片检查与HPLC 结果

1 029 例患者的血样本经HPLC 法检测，有439 例HbA2>3.5%，其中423 例（96.4%）经基因诊断确诊为β-珠蛋白生成障碍性贫血、αβ-珠蛋白生成障碍性贫血和Hb 变异体（见图3A、3B、3E、3F），其HbA2值为3.6%～72.7%。这423 例患者的外周血红细胞参数检测结果主要表现为红细胞计数降低、增高或正常，轻度至中度贫血，血象呈小细胞低色素性改变。

另经HPLC 检测检出存在快速区带[（0.125±0.021）min 和（0.406±0.091）min 处]者共40 例（见图3C、3D），经基因诊断其中39 例被确诊为HbH病，占97.5%（39/40），其HbA2值为0～2.1%，外周血红细胞参数检测结果表现为红细胞计数正常或降低，轻至中度贫血，血象呈小细胞低色素性改变，伴明显异型性。

图3 血红蛋白HPLC 分析图谱

1 029 例患者中，经基因检测显示，其中珠蛋白基因阴性者有422 例，其HbA2值为0～6.2%。基因检测阴性组与α 珠蛋白生成障碍性贫血（标准型和静止型）组（P=0.421>0.05）间HbA2水平比较，β-珠蛋白生成障碍性贫血组与αβ-珠蛋白生成障碍性贫血组（P=0.572>0.05）间HbA2水平比较，差异均无统计学意义外，其余各疾病组间比较均有统计学意义（P<0.05）。基因检测阴性组与珠蛋白生成障碍性贫血组及异常Hb 病组间比较，RBC、MCV、MCH值差异均有统计学意义（P<0.05）（见表2）。

表2 各组HbA2及RBC 参数均值比较（ ）

表2 各组HbA2及RBC 参数均值比较（ ）

Hb：血红蛋白；MCV：平均红细胞体积；MCH：平均红细胞血红蛋白量；MCHC：平均红细胞血红蛋白浓度。

对HPLC 图形异常，但常规珠蛋白生成障碍性贫血基因筛查为阴性的标本，根据HPLC 中Hb 变异体的洗脱时间、在总Hb 中的百分含量和色谱图形特征，结合基因分析结果，通过HbVar（http://globin.cse.psu.edu/hbvar/menu.html）进行比对，共发现了14 例共10 种Hb 变异体，分别为Hb E（2 例）、Hb Q-Thailand（2 例）、Hb Youngstown（2 例）、Hb GTaipei（2 例）、Hb Tamano（1 例）、Hb G-Siriraj（1 例）、Hb Guangzhou-Hangzhou（1 例）、Hb M-Boston（1 例）、Hb J-Baltimore（1 例）和Hb J-Sicilia（1 例），2 例Hb Q 均检测出缺失型α 地中海贫血基因型-α4.2。各种异常Hb 的HPLC 色谱图见图4。

图4 各种异常Hb 的HPLC 色谱图

三、HPLC 检测HbA2 诊断β-珠蛋白生成障碍性贫血的效能

以基因检测结果作为诊断β-珠蛋白生成障碍性贫血(携带者和轻型)的金标准，根据HPLC 检测HbA2的结果，利用MedCalc 软件绘制受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线，诊断β-珠蛋白生成障碍性贫血曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.962（P=0.000 1），HbA2>3.9%时，其诊断灵敏度为95.84%，特异度为96.87%，阳性似然比30.67%，阴性似然比0.043%，阳性预测值95.40%，阴性预测值97.20%（见图5A）。

四、HPLC 诊断α-珠蛋白生成障碍性贫血的效能

以基因检测结果作为诊断α-珠蛋白生成障碍性贫血（静止型、标准型和HbH 病）的金标准，根据HPLC 检测α-珠蛋白生成障碍性贫血（静止型和标准型）HbA2的结果，利用MedCalc 软件绘制ROC曲线，最大AUC 为0.753（P=0.000 1），HbA2≤3.2%时的诊断α-珠蛋白生成障碍性贫血（静止型、标准型）灵敏度为97.76%，特异度为53.11%，阳性似然比2.09%，阴性似然比0.042%，阳性预测值24.0%，阴性预测值99.4%。HPLC 检测中间型α-珠蛋白生成障碍性贫血（HbH病）HbA2的结果，AUC为0.990（P=0.000 1），HbA2≤2.1%时的诊断中间型α-珠蛋白生成障碍性贫血的灵敏度为100.0%，特异度为96.32%，阳性似然比27.14%，阴性似然比0，阳性预测值52.6%，阴性预测值100.0%。α-珠蛋白生成障碍性贫血（静止型和标准型）的AUC 与中间型α-珠蛋白生成障碍性贫血（HbH 病）的AUC 差异有统计学意义（P<0.000 1）（见图5B、5C）。

图5 HPLC 检测HbA2 诊断α-和β-珠蛋白生成障碍性贫血患者的ROC 曲线

五、红细胞参数诊断α-、β-和αβ-珠蛋白生成障碍性贫血

以基因诊断的结果作为诊断珠蛋白生成障碍性贫血（α-、β-和αβ-）的金标准，检测珠蛋白生成障碍性贫血患者MCV 的结果，利用MedCalc 软件绘制ROC 曲线，AUC 为0.870（P=0.000 1），取MCV 73.3 fl 作为临界值时的诊断灵敏度为87.98%，特异度为77.51%，阳性似然比为3.91%，阴性似然比为0.16%，阳性预测值为84.3%，阴性预测值为82.4%。检测珠蛋白生成障碍性贫血患者MCH 的结果，AUC 为0.829（P=0.000 1），取MCH 23.5 pg 作为临界值时的诊断灵敏度为93.73%，特异度为69.86%，阳性似然比为3.11%，阴性似然比为0.09%，阳性预测值为81.0%，阴性预测值为89.0%。MCHC 检测诊断珠蛋白生成障碍性贫血的AUC 为0.639（P=0.000 1），取MCHC 324 g/L 作为临界值时的诊断灵敏度为89.20%，特异度为47.61%，阳性似然比为1.70%，阴性似然比为0.23%，阳性预测值为70.0%，阴性预测值为76.2%（见图6）。

图6 MCV、MCH 和MCHC 检测诊断珠蛋白生成障碍性贫血患者的ROC 曲线

六、HPLC 检测及红细胞参数辅助诊断β-和中间型α-珠蛋白生成障碍性贫血

HPLC 检测联合红细胞平均指数筛查β-和中间型α-珠蛋白生成障碍性贫血的结果与基因检测结果间的一致性强（Kappa=0.926，P<0.001）。以基因检测结果作为诊断珠蛋白生成障碍性贫血的金标准，比较HbA2和红细胞平均参数对β-珠蛋白生成障碍性贫血和中间型α-珠蛋白生成障碍性贫血（HbH 病）的筛查价值，利用MedCalc 软件绘制ROC 曲线（见图7），HbA2、MCV、MCH 和MCHC 检测诊断β-珠蛋白生成障碍性贫血的AUC 依次为0.962、0.815、0.763 和0.552；诊断HbH 病的AUC依次为0.990、0.749、0.849 和0.829。

图7 HbA2 和红细胞平均参数诊断珠蛋白生成障碍性贫血的ROC 曲线

讨 论

Hb 病中珠蛋白生成障碍性贫血是由于基因缺失或突变造成珠蛋白肽链合成速率改变的遗传性溶血性疾病，较常见的受累基因为α-和β-珠蛋白基因，分别导致α-和β-或αβ-珠蛋白生成障碍性贫血，而异常Hb 病是珠蛋白基因缺陷导致珠蛋白肽链分子结构异常而形成Hb 变异体的疾病。临床上对Hb 病的表型筛查主要依靠红细胞平均参数和（或）Hb 分析，基因型的确诊则需要采用基因诊断。对疑似患者血液中的各种Hb 进行定性和定量分析是一种快速、可靠的表型筛查方法。

一、HPLC 检测HbA2 的最佳临界值建立

HPLC 是以离子交换作为工作原理，利用携带负电荷的层析柱和珠蛋白成分的电荷差异进行分离，带正电荷越强的Hb，洗脱时间越长，在分离的同时，根据出峰位置可以定性，根据峰的面积可以定量。HPLC 检测能快速、简便、准确地对Hb 进行分析。国内文献报道[3]，琼脂糖凝胶电泳法检测中，可 以HbA2≥4.0%、HbA2≥3.9%、HbA2≥3.8%、HbA2≥3.5%为临界值诊断β-珠蛋白生成障碍性贫血携带者；而HPLC 法检测中，可以HbA2≥4.0%、HbA2≥3.8%、HbA2≥3.45%为临界值诊断β-珠蛋白生成障碍性贫血携带者[4-7]。因此，不同的电泳方法必须制定各自的HbA2临界值，各实验室也有必要建立自己的HPLC 检测HbA2的最佳临界值，以提高β-珠蛋白生成障碍性贫血筛查试验的准确性[8]。

二、红细胞参数在辅助诊断珠蛋白生成障碍性贫血中的价值

文献报道，当同时MCV<80 fl、MCH<27 pg及HbA2>3.5%，即提示受检者可能为β-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者，即轻型杂合子[9]。当MCV<80 fl、MCH<27 pg 时；而HbA2正常或偏低，提示受检者可能为α-珠蛋白生成障碍性贫血或αβ-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者。陈雅斌等[10]认为，MCV<82.1 fl 和（或）MCH<27.3 pg 联合HbA2<3.05%或HbA2>3.90%标准在珠蛋白生成障碍性贫血筛查中具有较好的诊断效能。本研究中α-珠蛋白生成障碍性贫血、β-珠蛋白生成障碍性贫血和αβ-珠蛋白生成障碍性贫血患者的MCV 和MCH 值均明显低于非Hb 病者，而红细胞计数明显高于非Hb病者。以MCV≤73.3 fl、MCH≤23.5 pg、MCHC≤324 g/L 诊断受试各组珠蛋白生成障碍性贫血的灵敏度和特异度均较高。

异常Hb 病组的MCV、MCH 明显高于基因阴性组，红细胞计数则明显低于基因阴性组，MCHC均值与基因阴性组差异无统计学意义（P>0.05）。原因可能在于本研究纳入的异常Hb 病患者多伴随其他血液病，从而掩盖了因Hb 自身因素对红细胞参数的影响。

三、HPLC 检测筛查Hb 病的价值

鉴于上海地区不属于Hb 病的高发区域，但随着流动人口的增加以及外来人口的迁入，造成了上海地区Hb 病患者人数有了一定增长。采用HPLC检测对Hb 进行分析，检测效率和准确率均较高，因此本研究选择用该法作为快速筛查Hb 病的首选方法。本实验室在上海地区率先使用BIO-RAD VARIANT Ⅱ高效液相色谱分析仪对1 029 例临床疑似Hb 病或行溶血筛查的标本进行Hb 分析，结果显示HbA2>3.9%诊断β-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者的灵敏度和特异度最高；HbA2≤2.1%诊断中间型α-珠蛋白生成障碍性贫血（HbH 病）的灵敏度和特异度最高，结合快速区带的检出，可准确筛查出该型α-珠蛋白生成障碍性贫血患者。这与马升俊等[11]的报道相近，提示采用HPLC 检测Hb对中间型α-珠蛋白生成障碍性贫血（HbH 病）有较高的诊断准确率，而采用该方法诊断静止型和标准型α-珠蛋白生成障碍性贫血则容易存在漏诊。

本研究比较了HbA2和红细胞平均参数对Hb病的筛查价值后发现，以上指标筛查β-珠蛋白生成障碍性贫血的价值由高至低依次为HbA2、MCV、MCH、MCHC；筛查中间型α-珠蛋白生成障碍性贫血（HbH 病）的价值由高至低依次为HbA2、MCH、MCHC、MCV。MCV≤73.2 fl、MCH≤23.5 pg、MCHC≤326 g/L、HbA2>3.9%对β-珠蛋白生成障碍性贫血的筛查具有较好的效能；MCV≤65.2 fl、MCH≤19.5 pg、MCHC≤301 g/L 且HPLC 法检测HbA2≤2.1%，并伴快速区带，筛查中间型α-珠蛋白生成障碍性贫血（HbH 病）的效能较佳；对于红细胞计数正常或升高，红细胞平均参数明显低于正常，而贫血程度较轻或无贫血者，HPLC 检测Hb 显示HbA2正常或偏低时，应考虑进行α-珠蛋白生成障碍性贫血基因分析，以免漏诊静止型和标准型α-珠蛋白生成障碍性贫血。

总之，应用HPLC 分析Hb 和红细胞参数（MCV、MCH 和MCHC 等）诊断β-珠蛋白生成障碍性贫血、中间型α-珠蛋白生成障碍性贫血（HbH病）和异常Hb 病有较高的准确率，可用于该类Hb病的快速筛查，尤其在Hb 病非高发区，应用此法进行筛查，可减少基因检测的费用和时间，有一定的临床价值和实用性。对于少见的异常Hb 病，可在HPLC 筛查基础上再进行基因诊断，能提高此类疾病的阳性检出率。对静止型和标准型α-珠蛋白生成障碍性贫血特异度和阳性预测值均较低，应结合临床资料和基因检测来进行综合分析，以降低漏诊率。