葡萄籽原花青素对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖和凋亡的影响

李晓民 梁韦巍 韩 冬 刘爱芹 韩志强

1山东省潍坊市皮肤病防治所，潍坊，261061；2山东省潍坊市安丘市妇幼保健医院，潍坊，262100

皮肤鳞状细胞癌是一种好发于颜面部常见的非黑素性恶性肿瘤[1]，大约5%的患者发生淋巴结转移，严重威胁患者的生命健康[2]。目前皮肤鳞状细胞癌治疗仍以手术、放疗为主，对于不宜手术、复发或淋巴结转移的患者采取化学治疗[3]。化疗药有诸多严重不良反应，开发新型高效化合物用于皮肤癌治疗具有重要意义。

葡萄籽原花青素(grapeseedproanthocyanidin，GSP)具有抗氧化[4]、心血管保护[5]、抗肿瘤[6]等多种生物活性和药理作用，用于化妆品中可使皮肤老化减慢[7]。研究发现Akt/GSK-3β信号通路与鳞癌细胞的增殖迁移等生物学过程有关[8，9]，然而关于葡萄籽原花青素是否通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路活化抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖的研究甚少。因而，本研究旨在观察GSP对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖和凋亡的影响，及GSP对PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431细胞购自中国科学院细胞库。DMEM培养液购自美国Hylcone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司。葡萄籽原花青素(纯度≥90%)、Hoechst33258购自美国Sigma公司。兔抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-GSK-3β及GSK-3β抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；鼠抗GAPDH抗体购自上海康成生物工程有限公司。抗兔IRdye700及抗鼠IRdye800荧光二抗购自美国LI-COR公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A431细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5% CO2条件下的CO2孵箱中进行培养。细胞融合到90%左右进行传代培养。

1.2.2 MTT检测细胞活力取对数生长期的A431细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养24 h后，加入不同浓度的葡萄籽原花青素(5、10、20、40、80 μg/mL)和顺铂(Cis，3 μM)处理24、48、72h。GSP采用灭菌的PBS溶解，加到无血清的DMEM培养液处理，对照组加等量的PBS。加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT工作液，放置于37℃的孵箱中恒温作用4 h，弃去孔中的液体，加DMSO 100 μL，震荡10 min使结晶完全溶解，酶标仪测定570 nm波长处的细胞吸光度A值，计算细胞相对存活率(%)=A实验组/A对照组×100%。

1.2.3 细胞克隆实验对数生长期的A431细胞，经胰蛋白酶消化成单细胞悬液。以1000个/孔将细胞接种于6孔板，加GSP(5、10、20、40、80 μg/mL)和Cis 3 μM处理细胞，每3d更换一次含有药物的新鲜培养液，9天后对细胞进行染色计数。

1.2.4 细胞凋亡检测将对数生长期的A431细胞以1×104个/孔接种于24孔板，加不同浓度的GSP和Cis 3 μM处理48 h后，PBS清洗2次，每次5min，收集细胞，加入0.5 μg/mL的Hoechst 33258染色液染色10 min，PBS清洗2次，碳酸甘油缓冲液封片，于镜下观察细胞形态变化，并选取5个视野，计数凋亡细胞的百分比，取平均值。

1.2.5 Western blot实验 细胞经药物处理后，收集细胞加适量细胞裂解液，置于冰上裂解30 min，12000 rpm、4℃条件下离心30 min，收集上清液。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，与加样缓冲液混合后煮沸5 min蛋白变性。每孔加样60 μg进行SDS-PAGE电泳分离、转膜，7.5%的脱脂牛奶封闭2 h后，加孵育一抗(p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β及GAPDH抗体，1∶500)，室温30 min后，置于4℃冰箱过夜，TBST清洗3次，室温孵育荧光二抗2h(1∶5000)，TBST清洗3次，采用Odyssey红外荧光扫描系统扫描条带。蛋白灰度值采用Quantity One软件进行分析。

组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验统计学差异，以Dunnett’s检验比较组间均数的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSP对A431细胞活力的影响 MTT实验结果显示加入不同浓度的GSP(0, 5, 10, 20, 40, 80 μg/mL)后，发现GSP呈浓度和时间依赖性地降低A431细胞的活力(P<0.01)，见图1a；与对照组相比较，Cis处理24 h、48 h和72 h后细胞活性显著下降，见图1b。进一步采用细胞克隆实验分析，与对照组相比较，A431细胞经GSP(20, 40, 80 μg/mL)或Cis处理后，细胞的克隆形成能力受到明显抑制(P<0.05)，见图2a、2b。

图1 细胞活性测定 1a:GSP对细胞活性的影响；1b:Cis对细胞活性的影响。与对照组相比较，**P<0.01 图2 GSP对A431细胞克隆形成的影响 2a:细胞克隆实验典型图片, A431经GSP 40 μg/mL处理；2b:GSP和Cis对A431细胞克隆数目的影响。与对照组相比较，*P<0.05,**P<0.01

2.2 GSP诱导A431细胞凋亡 Hoechst 33258染色结果显示，A431细胞经GSP(10, 20, 40, 80 μg/mL)或Cis处理后，与对照组相比较，凋亡细胞的百分比显著增加(P<0.05)，见图3a、3b。

3a：Hoechst 33258染色A431细胞凋亡情况，3b：GSP和Cis对A431细胞的凋亡细胞百分比的影响。与对照组相比较，**P<0.01；bar=100 μm

2.3 GSP调节A431细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号传导 结合上述实验结果，当GSP浓度为40 μg/mL时细胞活性抑制率为47.48%，接近半数抑制浓度，而且凋亡增加，组间比较差异显著(P<0.05)，因而使用GSP作用48 h后，Western blot检测信号通路蛋白表达。结果显示，与对照组相比，当浓度为40 μg/mL GSP处理后实验组细胞的p-PI3K、p-Akt和p-GSK-3β表达水平明显降低，提示GSP能够有效抑制PI3K/Akt和GSK-3β蛋白磷酸化，能够抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路(图4a、4b)。

4a: Western blotting检测蛋白表达典型图片, A431经GSP 40 μg/mL处理；4b: GSP对p-PI3K/p-Akt/ p-GSK-3β蛋白相对表达的影响。与对照组相比较，*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

GSP是来源于葡萄等多种植物的一类黄酮多酚类物质[10]，已发现对结肠癌等多种肿瘤具有较好的药理作用，但对于皮肤鳞状细胞癌是否具有潜在治疗价值，以及具体的机制研究并不深入。本实验以人皮肤鳞状细胞癌为研究对象，观察GSP对人皮肤鳞状细胞癌细胞A431细胞增殖和凋亡的影响，初步了解GSP对皮肤鳞状细胞癌作用的下游信号通路，为其用于皮肤鳞状细胞癌的治疗提供新线索。

本实验中，我们发现GSP显著抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖，随着剂量和时间呈依赖性抑制细胞活力。这些结果表明GSP对人皮肤鳞状细胞癌具有很好的药理活性。Hoechst 33258染色结果显示GSP(10, 20, 40, 80 μg/mL)显著增加A431细胞凋亡，提示GSP通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。研究表明，原花青素诱导结肠癌、肝癌细胞等癌症细胞的凋亡[11，12]，可能是一种非常有价值的潜在癌症治疗药物。

Akt/GSK-3β信号通路在多种恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，包括皮肤癌[13]。在皮肤鳞状细胞癌中发现PI3K/Akt信号通路异常活化，与肿瘤增殖、迁移、细胞凋亡等肿瘤行为密切相关[14]。PI3K是细胞内信号转导的重要激酶，PI3K活化使Akt在Ser473位点磷酸化被激活，进一步磷酸化下游的GSK-3β[15]。在结肠癌和骨肉瘤细胞，原花青素通过调节PI3K/Akt信号通路诱导细胞凋亡[16，17]。体内外实验研究表明，原花青素通过PI3K/Akt通路调节体内的细胞损伤和组织修复过程[18，19]。PI3K/Akt通路可能是原花青素发挥作用的重要途径之一。在原代培养的大鼠心肌细胞，原花青素能够调节GSK-3β保护缺氧再灌注诱导的心肌细胞损伤[20]。本实验发现原花青素可以显著抑制A431细胞中PI3K/Akt/GSK-3β信号转导，可能是抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的原因之一，但具体的作用机制还需要进一步研究。

综上所述，本研究发现GSP能够抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖能力，诱导细胞凋亡，可能与抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号转导有关。