厦门地区儿童流感嗜血杆菌流行特点及耐药性分析

王金辉 陈 雷 黄美恋 庄鸿源

厦门市儿童医院检验科，福建厦门 361006

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，HI）是引起儿童呼吸道感染的常见病原菌，是儿童社区获得性肺炎的重要病原体，可引起肺炎、支气管炎、化脓性脑膜炎、脓毒血症等多种疾病，严重威胁儿童的身体健康[1]。近年来，临床抗生素的广泛使用，使流感嗜血杆菌的耐药性逐年增加，临床治疗难度越来越大[2]。本课题组分析了2019年1—12月厦门市儿童医院呼吸道感染就诊患儿的流感嗜血杆菌流行情况，并对痰液标本培养分离出的流感嗜血杆菌的耐药情况及β-内酰胺酶基因进行分型，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2019年1—12月厦门市儿童医院呼吸道感染患儿的痰液标本31 163份，经培养后使用德国BRUKER MALDI TOP微生物快速鉴定系统进行菌种鉴定。

1.2 主要仪器和试剂

微生物快速鉴定系统（德国BRUKER公司，BRUKER MALDI TOP）；嗜血杆菌属培养基（HTM）平板（美国BD公司）；药敏试验鉴定仪（法国梅里埃公司，VITEK 2 Compact）；头孢硝噻吩纸片（中国庞通医疗公司）；PCR扩增仪（美国ABI公司7500型）。

1.3 β-内酰胺酶表型检测

用头孢硝噻吩纸片法，按照试剂说明书操作：用无菌去离子水浸湿纸片，沾取少量待测菌菌落到纸片表面。红色出现为阳性结果，即细菌产β-内酰胺酶；1 h后无颜色改变为阴性，即细菌不产β-内酰胺酶。

1.4 β-内酰胺酶基因分型

采用煮沸法提取流感嗜血杆菌DNA：取流感嗜血杆菌混匀于0.5 ml生理盐水中，浓度高于1麦氏浊度单位，悬液于100℃ 10 min，冷却后13 800 g 离心1 min，取上清液，-20℃保存。流感嗜血杆菌β-内酰胺酶TEM-1和ROB-1基因引物、PCR扩增条件和β-内酰胺酶基因分型方法见参考文献[3-4]。引物由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增反应体系 50 μl，包括 10 mmol/L dNTP 4 μl，10×buffer 5 μl，Taq DNA 聚合酶 1 μl，上、下游引物（20 μmol/L）各 1 μl，DNA 模板 2.5 μl，ddH2O 35.5 μl。扩增条件：94℃ 10 min；94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 45 s，30 个循环；72℃ 10 min。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后观察结果。部分PCR扩增产物送上海生工生物工程公司测序，测序结果在GeneBank数据库中网上查询比较，进行Blast比对分析。

1.5 统计学分析

使用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计数资料以%表示，组间差异使用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。使用WHONET 5.5软件进行细菌耐药性分析。

2 结果

2.1 流感嗜血杆菌检出率及不同年龄段的分布情况

2019年共收到31 163份痰标本，经培养后，其中3491份标本阳性。经鉴定检出HI阳性标本841株，占阳性标本的24.09%。不同的年龄段分布情况如下：＜1岁的婴幼儿占比28.15%，幼儿期（1～＜3岁）占28.10%；学龄前期（3～7岁）占18.82%；学龄期（＞7岁）占5.46%，见表1。

表1 2019年儿童痰液标本流感嗜血杆菌的检出率及不同年龄段的分布情况

2.2 流感嗜血杆菌的季节分布情况

2019年共841株HI临床株，第一季度检出364株（43.28%），第二季度检出303株（36.03%），第三季度检出61株（7.25%），第四季度检出113株（13.44%）。

2.3 流感嗜血杆菌的耐药情况分析

2019年检出流感嗜血杆菌的对抗菌药物的耐药情况见表2、图1，841株HI阳性菌株的药敏实验结果见表2。其中复方磺胺甲噁唑的耐药率最高为74.78%，氯霉素的耐药率最低为3.18%。同时课题组查阅了www.chinets.com网站数据，将2019年厦门市儿童医院流感嗜血杆菌的耐药情况与同年CHINET公布的流感嗜血杆菌（儿童）数据进行比较，除氨苄西林/舒巴坦组外，各组的耐药率与CHINET的数据差异无统计学意义。而氨苄西林/舒巴坦的耐药率为3.57%，与2019年CHINET数据（32.8%）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 2019年流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药情况且与2019年CHINET数据比较

图1 2019年厦门市儿童医院流感嗜血杆菌耐药情况与2019年CHINET数据比较

2.4 流感嗜血杆菌β-内酰胺酶表型结果及基因分析

841株流感嗜血杆菌β-内酰胺酶检出率为41.85%（352/841），检测到β-内酰胺酶基因与头孢硝噻吩纸片法结果一致。β-内酰胺酶的基因型均为TEM-1型，见图2。

图2 流感嗜血杆菌TEM-1型和ROB-1型内酰胺酶基因扩增产物电泳图

3 讨论

流感嗜血杆菌是儿童发生社区获得性肺炎的重要病原体，基于鉴定条件及耐药机制的复杂性，HI的分布和耐药性具有地域性差异[5-6]。本课题组对2019年厦门市儿童医院呼吸道感染患儿的痰液标本分离出的HI进行分析，HI的检出率占总检出率的24.09%，2019年CHINET官网（www.chinets.com）的数据显示在101 714份呼吸道标本中，HI在的分离率为8.92%，我院2019年的分离率远高于CHINET统计数据[7]。儿童的呼吸道标本中，分离出的细菌种类与成人细菌种类分布不同，儿童以肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、奈瑟卡他菌为主[8]。本课题组统计2019年HI高于CHINET的统计数据，这与儿童医院专科特点相关，符合儿童呼吸道细菌阳性分布的特点[9]。

在不同年龄分布情况显示，＜3岁幼儿的HI阳性的检出率高于3岁以上儿童的检出率，而≤1岁和1～3岁年龄组的检出率相似，分别为28.15%和28.10%，高于其他年龄段，这可能由于幼儿期免疫系统尚未发育健全，肺清除能力不足，使流感嗜血杆菌的定植概率增加所致[10]。季节分布结果显示一、二季度流感嗜血杆菌的检出率高于三、四季度，与汪倩钰等[11]报道的2016—2018年儿童呼吸道感染病原谱中的结果相一致。厦门地区一、二季度气温相对较低且潮湿，冷热交替，且早晚温差大，因此容易出现流感嗜血杆菌感染相关的呼吸系统疾病。

儿童革兰阴性杆菌感染的主要菌群是流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌。流感嗜血杆菌的药敏试验显示对复方新诺明、氨苄西林的耐药率较高，这一点与陈姗姗等[12]报道的山西省儿童医院流感嗜血杆菌的分布及耐药情况分析相一致。本课题组对流感嗜血杆菌的耐药性进行了分析，本研究药敏结果显示，HI对复方磺胺甲噁唑的耐药率最高为74.78%，略高于CHINET的数据（70.4%），其耐药机制主要是染色体介导的二氢叶酸还原酶过量产生，导致与甲基苄氧嘧啶的结合减少所致[13]。对氨苄西林的耐药率为62.34%，低于2019年CHINET的数据（71.1%）；而氨苄西林和阿莫西林是治疗感染常用的药物，但由于HI的耐药率逐年升高，不宜作为临床经验用药[14]。

本课题组对流感嗜血杆菌的β-内酰胺酶的检出率为41.85%，提示本地区产β-内酰胺酶是导致HI对氨苄西林耐药的主要机制。同时对其基因型进行检测，发现绝大部分是TEM-1型，水解氨苄西林使其失活，此结果与秦惠宏等[15]的报道一致。本课题组发现氨苄西林/舒巴坦的耐药率我院为3.57%，远低于CHINET的数据（32.8%），差异有统计学意义（P＜0.05）。氨苄西林/舒巴坦联合应用，不仅可保护β-内酰胺类抗生素（氨苄西林）免收酶的水解破坏，增强其抗菌作用，而且还扩大了抗菌谱，增强了抗菌活性，具有广谱、耐酶的特点。因此临床可选择氨苄西林/舒巴坦治疗因流感嗜血杆菌引起的呼吸道感染。我院的结果与CHINET的数据有差异，可能有两方面原因：一是CHINET数据包括全国不同地区综合医院和儿童医院的数据，数据来源宽泛；二是细菌耐药的分布具有年龄和地域的差异，在厦门地区儿童HI对氨苄西林/舒巴坦的耐药率低，具有地域特色[16]。

综上所述，HI是儿童呼吸道感染的重要病原体，3岁以下的婴幼儿是易感人群，感染率与气候相关，冬季是高发季节，且产β-内酰胺酶的HI比例较高，应根据药敏结果选择药物进行治疗。