非生物胁迫对橡胶树热激转录因子家族成员表达的影响

李言 余文才 陆庆志 杨署光 田维敏

摘  要：热激转录因子（heat shock transcription factor， Hsf）是一类重要的调节因子，能够使植物响应多种逆境胁迫，赋予植物多种抗逆性。通过qPCR技术，分析了30个橡胶树HbHsf家族成员在低温胁迫下橡胶树‘93-114和‘热垦501叶片中的表达模式，结果显示多个HbHsfs基因可被低温诱导上调表达，尤其是HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA9b、HbHsfC1a和HbHsfC1b在低温胁迫下‘93-114叶片中的表达量显著高于‘热垦501。此外，HbHsfA4a和HbHsfA4d在干旱和髙盐胁迫下显著上调表达，HbHsfA9b在干旱条件下极显著上调表达，HbHsfC1a和HbHsfC1b响应髙盐胁迫上调表达。橡胶树HbHsfs基因响应多种逆境交叉胁迫，暗示着基因功能的多样性和复杂性。本研究为进一步解析Hsf家族成员的抗逆机理提供理论依据。

关键词：巴西橡胶树;热激转录因子;非生物胁迫;低温胁迫;干旱胁迫;髙盐胁迫

Abstract： Heat shock transcription factor （HSF） is an important regulatory factor， which can response to multiple abiotic stresses and confers various tolerances to plants. Through qPCR， we analyzed the expression patterns of 30 members of the HbHsfs family in the leaves of rubber tree ‘93-114 and ‘Reken 501 under cold stress. The results showed that many HbHsf genes could be up-regulated by cold stress， especially the expressions of HbHsfA4a， HbHsfA4d， HbHsfA9b， HbHsfC1a and HbHsfC1b in the leaves of ‘93-114 were significantly higher than those in ‘Reken 501 under cold stress. In addition， HbHsfA4a and HbHsfA4d were up-regulated under drought and salt stress， HbHsfA9b was up-regulated under drought， and HbHsfC1a andHbHsfC1b were up-regulated in response to high salt stress. The HbHsf genes of rubber tree responded to multiple stresses， suggesting the functional diversity and complexity. It would provide a theoretical basis for further analysis of the stress resistance mechanism of the Hsf genes.

Keywords： Hevea brasiliensis Muell. Arg.; heat shock transcription factor; abiotic stresses; cold stress; drought stress; salt stress

熱激转录因子（heat shock transcription factor， HSF）在植物适应生物胁迫和非生物胁迫的过程中起着重要的调节作用，赋予植物多种抗逆性。热激转录因子家族成员序列大小不一，但结构域比较保守，主要包含N端高度保守的DNA结合结构域（DNA-binding domain， DBD），它可识别并结合热激元件（heat shock element， HSE）从而激活热激蛋白（heat shock protien， HSP）基因的转录;依次是寡聚化结构域（oligomerization domain， OD），由2个疏水七肽重复区域（HR-A和HR-B）组成，并通过一段可变长度（15～80个氨基酸残基）的柔性序列连接到DBD。该结构域可促进与HSP启动子中HSE的结合，调控HSP的转录[1-2];接着是核定位信号（nuclear localization signal， NLS）和核输出信号（nuclear export signal， NES），NLS是一簇碱性氨基酸区域，与进入细胞核有关。NLS和NES协同调控Hsfs在细胞核和细胞质中的分布;C端转录激活结构域（C-transcriptional activation domain， CTD）含有短肽AHA（aromatics， hydrophobic and acidic acid residues）基序，具有转录激活功能。根据Hsfs结构特点，将植物Hsfs分为3个主要亚家族（HsfsA、B和C）[1， 3]。橡胶树Hsfs家族共30个成员，也分为HsfsA（18）、B（10）和C（2）[4]。Hsfs能够识别热激元件HSE（GAAnnTTC）并与之结合，从而激活下游基因如HSP的转录，响应生物胁迫和非生物胁迫。小麦热激转录因子TaHsfA6f调控一系列下游基因（TaHsp16.8， 17， 17.3， TaGAAP， TaRof1）的转录，参与保护植物免受高温损伤[5]。枇杷EjHsf1通过调节下游基因EjHSP的转录响应低温胁迫[6]。拟南芥NPR1与HsfA1互作从而激活HsfA1参与低温胁迫反应[7]。DREB2A能够调控HsfA3的表达进而响应盐胁迫和干旱胁迫[8]。HsfA4a亦能提高拟南芥的耐盐性和耐氧化性[9]。植物Hsfs家族成员较多，结构复杂，功能多样，响应于多种逆境交叉胁迫，是一类理想的遗传改良候选基因。

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）是重要的热带经济作物，原产于亚马逊河流域。目前，已大规模种植于南亚或东南亚以及赤道附近南北纬度10之间的热带地区，该地区属于传统植胶区，无低温侵袭，且雨水充足。我国的橡胶树种植区位于热带北缘，属于非传统植胶区，经常遭遇寒潮侵袭，以及干旱危害。选育高产抗逆品种是保障我国天然橡胶高产稳产的有效途径。但是，由于橡胶树育种周期特别漫长，而且因缺乏高效的早期评选技术，高产性状和耐寒性状难于聚合，导致生产上的高产耐寒品种极度匮乏，严重影响我国天然橡胶产业的可持续发展。为了解决这一问题，可开发相应的分子标记辅助橡胶树的新品种培育，以及通过转基因技术提高高产橡胶树品种的耐寒性，创制新品种。本文分析了30个橡胶树Hsf家族成员在低温胁迫下橡胶树‘93-114和‘热垦501树叶中的表达模式，还鉴定了Hsf家族成员对干旱和高盐胁迫的响应。研究结果为进一步解析Hsf家族成员的抗逆机理提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

中国热带农业科学院橡胶研究所橡胶树种苗培育基地培育的橡胶树无性系‘93-114和‘热垦501袋装苗，处于稳定期一蓬叶幼苗。天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒;Ferments公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒;宝生物工程（大连）有限公司的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （TliRNaseHPlus）;其他生化试剂及耗材均为进口或国产分析纯试剂;引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2  方法

1.2.1  材料处理  恒温培养箱（PGR15，COVVILN，加拿大）用于室内处理橡胶树幼苗，设定28 ℃培养箱处理对照材料，设定4 ℃培养箱低温处理材料，其他条件设置为：相对湿度为80%，光照强度为125 μmol/（m2·s），16 h光照和8 h黑暗。

低温胁迫的处理方法：将橡胶树无性系‘93-114和‘热垦501袋装幼苗转移至28 ℃恒温培养箱中预培养2 d。然后把材料平均分为2组，以保留在28 ℃恒温培养箱中的一组作为对照，转移至4 ℃培养箱中的一组作为处理。在0、4、8、24 h分別采集对照和处理的幼苗树叶。每个时间段采集5株幼苗树叶制成1个混合样，共3次生物学重复。

干旱胁迫的处理方法：将‘93-114袋装苗在28 ℃预培养2 d，然后平均分为2组，一组在28 ℃恒温培养箱中继续培养，另一组除掉袋子和泥土，裸根置于28 ℃恒温培养箱中培养，在0、2、4、8、12、24 h分别收集叶片，每个时间段采集5株幼苗叶片制成1个混合样，3次生物学重复。

盐胁迫处理方法：将‘93-114袋装苗在28 ℃预培养2 d，然后平均分为2组，一组以400 mmol/L NaCl溶液浇灌袋装苗1次，另一组浇灌同样体积的水，然后继续置于28 ℃恒温培养箱中，分别在0、2、4、8、12、24 h 6个时间段收集叶片，每个时间段采集5株幼苗叶片制成1个混合样，3次生物学重复[4]。所有采集的样品都用于提取总RNA。

1.2.2  总RNA的提取与cDNA的合成  橡胶树叶片总RNA的提取参照天根生化科技（北京）有限公司的植物总RNA提取试剂盒的操作说明进行。cDNA第1链的合成根据Ferments公司试剂盒的操作步骤进行。

1.2.3  荧光实时定量PCR分析  采用Bio-Rad公司的CFX实时荧光定量PCR系统，实验操作按仪器使用说明书进行。合成的cDNA溶液稀释10倍后作为荧光定量PCR分析模板。反应体系10 ?L，包含模板1 ?L，2×SYBR Premix 5 ?L和每条引物0.3 ?L，无菌水补足10 ?L。用于qPCR的Hsfs引物和内参HbActin7a引物参照Li等[4]的文献。PCR反应程序为：95 ℃变性30 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。40个循环后进行溶解曲线分析。利用CFX manager 3.0软件自动进行基线和Cq值分析，算法为2–△△Cq法。

1.3  数据处理

采用T-test方法对基因表达水平进行差异显著性分析（P<0.05为显著差异;P<0.01为极显著差异）。

2  结果与分析

2.1  低温对热激转录因子基因表达的影响

依据橡胶树幼苗耐寒性室内评价鉴定体系，对30个橡胶树Hsfs家族成员在低温胁迫下‘93-114和‘热垦501叶片中的表达模式进行了分析。在30个橡胶树Hsf家族中，24个成员在‘93-114叶片中的本底表达量显著高于‘热垦501（图1）。在低温条件下，HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA5b、HbHsfA8a、HbHsfA9b、HbHsfC1a、HbHsfC1b、HbHsfB1a和HbHsfB2b在橡胶树‘93-114和‘热垦501叶片中均呈显著上调表达模式，其中HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA9b、HbHsfC1a和HbHsfC1b在‘93-114叶片中的表达量显著高于‘热垦501。C亚家族中的2个基因HbHsfC1a和HbHsfC1b在‘93-114和‘热垦501叶片中的表达模式非常相似，对低温胁迫比较敏感。在‘93-114和‘热垦501叶片中均呈显著下调表达的基因有HbHsfA3a、HbHsfA4b、HbHsfA5a、HbHsfB4c和HbHsfB4d五个基因，但是这些基因在‘93-114叶片中的表达量显著高于‘热垦501。另外，还有7个基因在‘热垦501中显著上调表达，而在‘93-114中呈显著下调表达模式，其中HbHsfA7a和HbHsfB2c在‘93-114中的转录水平依然高于‘热垦501（图1）。

2.2  干旱对热激转录因子基因表达的影响

在橡胶树30个Hsfs家族成员中，有28个成员响应干旱胁迫，只有HbHsfA1c和HbHsfA5b两个基因不响应干旱胁迫（图2）。在干旱处理的橡胶树‘93-114叶片中，HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA4c、HbHsfA4d、HbHsfA5a、HbHsfA6a、HbHsfA7a、HbHsfA9a、HbHsfA9b、HbHsfB1a、HbHsfB3a、HbHsfB4a和HbHsfB4b共13个基因响应干旱处理并呈持续显著上调表达模式，其中HbHsfA7a、HbHsfA7a和HbHsfB4b的上调幅度较大，在干旱处理4 h时它们的上调幅度是0 h的3倍以上，对干旱胁迫比较敏感。HbHsfA1b、HbHsfA2b、HbHsfA3a和HbHsfA4b响应干旱胁迫显著下调表达，其中HbHsfA1b和HbHsfA3a在干旱处理中后期持续显著下调表达，而HbHsfA2b和HbHsfA4b分别在干旱处理2 h和24 h时极显著下调表达，响应干旱胁迫的时间有明显差异。HbHsfA1a、HbHsfA2a、HbHsfB2c、HbHsfB3b、HbHsfB4d、HbHsfC1a和HbHsfC1b在干旱处理的前期上调表达，在后期下调表达;而HbHsfA8a和HbHsfB2b的表达模式与之相反，它们在干旱处理的前期下调表达，在后期上调表达（图2）。HbHsfB2a在干旱胁迫下先显著上调表达，然后显著下调，后期又极显著上调表达;而HbHsfB4c在干旱胁迫下先显著下调表达，然后显著上调，中后期又极显著下调表达（图2）。

2.3  高盐（NaCl）对热激转录因子基因表达的影响

在橡胶树30个Hsfs家族成员中，有29个成员响应NaCl高盐胁迫，只有HbHsfA1c不响应高盐胁迫（图3）。在高盐处理的橡胶树‘93-114叶片中，HbHsfA2b、HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA4b、HbHsfA5b、HbHsfA7a、HbHsfB1a、HbHsfB2a、HbHsfB2b、HbHsfB2c、HbHsfB3a、HbHsfB3b、HbHsfC1a和HbHsfC1b共14个基因响应高盐胁迫并呈持续显著上调表达模式，尤其HbHsfB2a和HbHsfB3a响应高盐胁迫上调幅度最大，在高盐处理2 h时它们的转录水平是0 h的2倍以上，对高盐胁迫比较敏感，而HbHsfA2b对高盐胁迫的反应比较滞后，在12 h之前无响应，在处理24 h时HbHsfA2b的表达迅速上调，几乎是0 h的3倍。HbHsfA1a、HbHsfA1b、HbHsfA3a和HbHsfA4c响应高盐胁迫显著下调表达，其中HbHsfA1a、HbHsfA3a和HbHsfA4c在高盐处理中后期持续显著下调表达，而HbHsfA1b在高盐处理8 h时极显著下调表达。HbHsfA2a、HbHsfA4d、HbHsfA5a、HbHsfA9b、HbHsfB4a、HbHsfB4b和HbHsfB4d、在高盐处理的前期显著上调表达，在后期显著下调表达，与这些基因表达模式相反的基因HbHsfA8a和HbHsfB4c分别在高盐处理的前、中期显著下调表达，在中、后期显著上调表达。HbHsfA6a和HbHsfA9a在高盐胁迫前期先显著上调表达，然后显著下调，后期又显著上调表达（图3）。

3  讨论

本研究分析了30个橡胶树HbHsf家族成员在低温胁迫下橡胶树‘93-114和‘热垦501叶片中的表达模式。结果表明，在HbHsf家族中有10个基因不仅在抗寒橡胶树种质‘93-114叶片中上调表达，也在不抗寒橡胶树种质‘热垦501叶片中显著上调表达。基因表达在不同组织中既有组织的特异性也有组织的相似性。比如上述叶片中上调表达的10个基因中，在低温条件下，HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA5b、HbHsfA8a、HbHsfC1a、HbHsfC1b和HbHsfB2b在橡胶树‘93-114和‘热垦501叶片中均呈显著上调表达模式，同时也在相应橡胶树的树皮中呈上调表达的模式，呈现组织的相似性。但是其他3个基因在树皮和叶片中的表达模式不一致，呈现组织的特异性[4]。在这2个不同耐寒性的橡胶树种质中都响应低温胁迫，但是响应程度不同。尤其HbHsfA4a在低温胁迫下橡胶树‘93-114叶片和树皮中的表达量均显著高于‘热垦501。这些基因表达量的高低可能与橡胶树抗寒性的强弱相对应。

枇杷EjHsf1（A4）响应低温诱导，通过转录调控EjHsp基因参与提高枇杷抵抗低温胁迫能力[6]。水稻OsHsfA4d受低温胁迫后上调表达[10]。OsHsfA4s在高盐胁迫后表达量上调[11]。草莓FvHsfA4a受低温和干旱胁迫上调表达[12]。橡胶树HbHsfA4a和HbHsfA4d是EjHsf1、OsHsfA4和FvHsfA4a的同源基因，同样受低温、干旱和高盐胁迫后表达量上调表达（图4），另外，HbHsfA4a受高温胁迫上调表达，而HbHsfA4d受高温诱导下调表达[4]。水稻OsHsfA3和OsHsfA9受低温胁迫后上调表达[10， 13]。草莓FvHsfA3a在高温、低温、干旱和高盐胁迫下上调表达，FvHsfA9a在低温和高鹽胁迫下上调表达[12]。辣椒CaHsfA3/A9受高盐胁迫上调表达[14]。同源基因HbHsfA3b在高温、低温、干旱和高盐胁迫下的橡胶树‘93-114叶片中上调表达，HbHsfA9b响应高温、低温和干旱上调表达（图4）。小麦B2亚家族TaHsf3响应高温、低温、干旱和高盐的诱导，过表达该基因激活下游基因热激蛋白HSP70，从而提高拟南芥植株的耐热性和抗寒性[15]。鹰嘴豆CarHsfB2在高温、高盐和干旱胁迫下上调表达，过表达CarHsfB2能够提高拟南芥植株的耐热性和抗旱性[16]。但是OsHsfB2b对水稻的抗旱性起负调控作用[11]。B1亚家族基因响应高温、干旱和高盐的诱导[2， 12， 14]。同源基因HbHsfB2b在高温、低温和高盐胁迫下的橡胶树‘93-114叶片中上调表达，HbHsfB1a响应高温、低温、高盐和干旱上调表达（图4）。水稻OsHsfC1a/b、OsHsfC2a/b在低温胁迫下表达量显著上调，其中OsHsfC1对低温胁迫最敏感[17]。拟南芥的AtHsfC1同样可被低温诱导，表达量极显著上调[18]。另外，在葡萄、胡萝卜和甘蓝等园艺植物中也发现VaHsfC1a、DcHsfC16和BraHsfC039受低温胁迫表达量显著上调[19-21]。由此可见，C亚家族成员在植物抵抗低温胁迫中也起着重要的作用。此外，小麦TaHsfC2a受高温胁迫上调表达，过表达TaHsfC2a可上调干旱和高温诱导基因的表达，提高转基因植株的耐热性[22]。OsHsfC1b在水稻抵抗高盐胁迫中起着重要的作用[23]。由此可见，橡胶树HbHsfA3b、HbHsfA4a、HbHsfA9b、HbHsfC1a、HbHsfC1b和HbHsfB2b等基因响应多种逆境交叉胁迫，暗示着上述基因功能的多样性和复杂性。

橡膠树响应高温胁迫的研究引自Li等[4]的文献。

高温、低温、高盐、干旱等逆境常常会导致植物体内发生氧化胁迫[24]。Hsfs是上调ROS清除酶的活性和HSP基因表达的关键因子，利于提高植物对逆境胁迫的抗性[1]。拟南芥体内的AtHsfA3受活性氧诱导表达量上调，过表达AtHsfA3的拟南芥植株中，该基因可直接结合肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS1和GolS2的启动子从而激活GolS1和GolS2的转录，肌醇半乳糖苷的含量显著增加，利于清除羟基自由基，以免植物细胞受到逆境胁迫的伤害[25]。过表达CmHsfA4能够上调转基因菊花中CmHSP70、CmHSP90等基因的表达，提高SOD、APX、CAT等活性氧清除酶的活性，降低植物细胞内活性氧的含量，从而增强了转基因植株的抗逆性[26]。东南景天SaHsfA4c转基因拟南芥可激活ROS清除酶的活性和上调HSP的表达，降低活性氧的积累，从而增加植物对逆境胁迫的抗性[27]。水稻体内OsHsfC2a响应H2O2诱导表达量上调，可以提高水稻对氧化胁迫的敏感性和抵抗能力[17]。由此可见，橡胶树HbHsfA3b、HbHsfA4a以及HbHsfC亚家族成员可能参与氧化胁迫反应，保护细胞免受氧化损伤，提高橡胶树的抗逆性。

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責任编辑：谢龙莲