短小芽孢杆菌与化学杀细菌剂协同防治烟草青枯病研究

冯永新 关辉 靳彦峰 徐伟 张卫东 谭宏祥 王静 王杰

摘 要：為探究短小芽孢杆菌与化学杀菌剂联合防控烟草青枯病的可行性，分别采用改良抑菌圈法和平板菌落计数法测定7种杀菌剂和短小芽孢杆菌AR03对青枯雷尔氏菌的毒力及杀菌剂与AR03的生物相容性，同时采用Horsfall法确定杀菌剂和AR03的复配比例。室内毒力试验结果表明，7种杀菌剂和AR03对青枯雷尔氏菌的生长均有较好的抑制作用。7种杀菌剂的毒力大小依次为三氯异氰尿酸、氯尿·硫酸铜、噻菌铜、溴菌·壬菌铜、甲霜·福美双、噻唑锌和中生菌素，EC50值介于101.02～212.70 mg/L之间。浓度为1.0×105～1.0×109 cfu/mL的AR03对青枯雷尔氏菌的抑菌率介于26.13%～73.54%之间，呈现浓度依赖性。生物相容性分析发现7种供试药剂与AR03的生物相容性差异较大，短小芽孢杆菌AR03与噻菌铜、噻唑锌、甲霜·福美双生物相容性较好，尤其是噻菌铜表现最好，测试浓度100 mg/L时，菌落数大于1×107 cfu/mL。综合杀菌剂对青枯病菌的毒力及其与AR03生物相容性，噻菌铜表现最优。噻菌铜（EC50=175.21 mg/L）与AR03（EC50=6.84×106 cfu/mL）复配剂在体积比为5∶5时，对青枯雷尔氏菌的抑制效果显著，增效作用明显，增效比率值IR值为1.482。室内盆栽试验结果表明，菌药复配剂的防效（68.77%）明显优于单剂噻菌铜和生防菌AR03的防效，且混配剂中噻菌铜使用量只有单剂的1/2，大幅降低了化学药剂的使用量。

关键词：烟草青枯病;高效药剂;短小芽孢杆菌;噻菌铜;增效作用

Abstract： To explore the potential of the control synergism of B. pumilus AR03 combined with seven tested fungicides against tobacco bacterial wilt， the toxicity of seven fungicides and AR03 strain against Ralstonia.solanacearum and the bio-compatibility of fungicides with AR03 were measured by the improved inhibition zone method and the plate colony-counting method， and the synergistic effect was determined by the Horsfall method. The results of in vitro toxicity test indicated that seven fungicides and AR03 all exhibited a good inhibitory effect on the growth of R. solanacearum， and the virulence of seven fungicides were trichloroiso cyanuric acid>chloroisobromine cyanuric acid plus copper sulfate>thiodiazole copper>bromothalonil plus cuppric nonyl phenolsulfonate> Metalaxyl plus thiram> thiadiazole zinc>Zhongshengmycin， and the half-maximal inhibitor concentration （EC50） ranged from 101.02-212.70 mg/L. B. pumilus AR03 also had a good inhibition rate （26.13%-73.54%） in a dose dependent manner at the concentration from 1.0×105 to 1.0×109 cfu/mL. Results from the bio-compatibility test showed that AR03 had good biocompatibility with thiodiazole copper， Metalaxyl plus thiram， thiadiazole zinc， while thiodiazole copper performed the best. When the test concentration of 100 mg/L， the number of colonies was greater than 1×107 cfu/mL. The mixture of thiodiazole copper （EC50=175.21 mg/L） and AR03 （EC50=6.84×106 cfu/mL） in the volume ratio of 5∶5 behaved a notable inhibitory and synergistic effect against R. solanacearum and yielded an IR value of 1.482. The results of in vivo experiment showed that the control effect of the combination was significantly higher than that of thiodiazole copper and AR03 strain treatment alone. More importantly， the usage volume of thiodiazole copper in the mixture was half of the single agent， which greatly reduced the use of chemical agents.

Keywords： tobacco bacterial wilt; high efficiency pesticides; Bacillus pumilus AR03; thiodiazole copper; synergistic effect

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的烟草青枯病是一种细菌性土传病害，其寄主范围广、致病机理和发病条件复杂多样，防治困难，缺乏有效药剂[1]。近年来该病害在云南、贵州、福建、四川、广东、广西等主栽烟区发生和为害十分严重[1-2]。目前，化学防治依然是防治烟草青枯病的主要手段，市面上用来防治烟草青枯病的常规化学药剂主要为无机铜、有机铜、有机氯、无机硫和有机硫类的杀菌剂[3]。然而，化学药剂长期不合理使用导致的致病菌抗药性和对人类健康与环境的危害不容忽视。随着农药减量化观点的提出，具有安全、低毒、对病原菌高度特异等优点的生物防治更受大家关注[4]。然而，受环境条件的多变性和土壤系统的复杂性影响，其防效稳定性差、效果不理想、显效慢，单一使用生防手段难以实现烟草青枯病的有效防控[5]。

生物-化学防治措施的联合使用可弥补二者各自的局限性和不足，成为一种切实可行且环境友好的防治策略。国内外已对化学杀菌剂和生防菌联用防控真菌病害展开了广泛深入的研究[6]，如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等分别与化学杀真菌剂联用防治葡萄霜霉病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、橡胶树根病等具有协同增效作用[7-11]。使用芽孢杆菌联合化学杀细菌剂防治烟草青枯病的研究鲜有报道。前期，我们发现并鉴定了一株对烟草多种病害具有较强拮抗活性的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）AR03菌株，能有效防治烟草青枯病、黑胫病及炭疽病，而且能在烟株根际及土壤中定殖，并具有促生作用[12]。本研究将筛选可与短小芽孢杆菌相容性较好的杀细菌剂，并进行复配剂比例优化和防效的测定，为烟草青枯病的防控提供新颖和实际有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料和药剂

供试病原菌株：于2019年广西靖西植烟区青枯病发病植株分离得到，经分子生物学方法鉴定为强致病力的青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）菌株，属1号生理小种。菌株放置在NA固体培养基上于30 ℃培养48 h，挑取单菌落转接到LB液体培养基中培养10～12 h （OD600=0.8～1.0），然后离心，收集菌体保存在25%甘油中，储存在–80 ℃冰箱中待用。

供试生防菌：本实验室从烟草青枯病严重发生的烟田土壤中分离得到的短小芽孢杆菌Bacillus pumilus AR03[12]（CGMCC No. 4117）。

供试药剂：52%氯尿·硫酸铜可溶粉剂，购于南京南农农药科技发展有限公司;3%中生菌素可湿性粉剂，从福建凯立生物制品有限公司获得;40%噻唑锌悬浮剂，购于浙江新农化工股份有限公司;35%甲霜·福美双可湿性粉剂，购买于丹东明珠科技有限公司;20%噻菌铜悬浮剂，购买于浙江龙湾化工有限公司;42%三氯异氰尿酸可湿性粉剂，购于湖南神隆海洋生物工程有限公司;25%溴菌·壬菌铜微乳剂，购于潍坊万胜生物农药有限公司。

1.2 供试化学药剂和AR03对青枯雷尔氏菌的毒力测定

毒力测定采用“改良抑菌圈法”[13-14]，先用滅菌水将每一种供试化学杀菌剂分别配制成制剂含量为25、50、100、150、200 mg/L的溶液。将灭菌晾干的直径6 mm中性滤纸片放在每一梯度浓度的药剂稀释液中，浸15 s，然后用灭菌镊子取出滤纸片沥干剩余的药液，将吸附药液的4张滤纸片呈“十”字状分别放置于培养皿中，吸取10 μL青枯雷尔氏菌液（1×108 cfu/mL），点接于培养皿中心处。以吸附无菌水处理作空白对照，每浓度3皿，然后放置在30 ℃培养箱中倒置培养48 h，全自动菌落分析仪Scan 4000（Interscience，France）测量菌落直径（mm），计算抑菌率，求EC50值。重复3次。

参照上述方法测定AR03菌悬液抑菌能力。用LB液体培养基将短小芽孢杆菌AR03培养24 h后，配制含菌量为1×105、1×106、1×107、1×108、1×109 cfu/mL的菌悬液。每重复每处理浓度3皿。重复3次。

1.3 AR03菌株与各化学药剂的生物相容性测定

将各化学药剂配制成制剂质量浓度为25、50、100、150、200 mg/L的LB平板，吸取AR03菌悬液100 μL，均匀涂布于培养基表面，然后放置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h，最后观察菌落生长情况，全自动菌落分析仪Scan 4000 （Interscience，France）记录菌落数量。以加等量无菌水的处理为空白对照（CK）。重复3次。

1.4 复配剂对青枯雷尔氏菌的毒力测定

1.4.1 复配剂对青枯雷尔氏菌的室内毒力测定 基于单剂毒力测定EC50结果，分别配制噻菌铜（175.21 mg/L）与短小芽孢杆菌AR03（6.84×106 cfu/mL）有效中浓度的药液。按AR03和30%噻菌铜悬浮剂体积比10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10等不同比例混合形成复配液，参照上述1.2的方法进行复配剂毒力测定，计算平均抑制率、理论抑制生长率，以加入等量无菌水为空白对照，每个处理3次重复。采用Horsfall法[15-16]进行联合毒力的增效计算。增效比率IR计算公式：IR=Eab/Eth，式中：Eab为复配剂的实际防效，Eth为复配剂的理论防效[14-15]。IR>1为增效作用;IR=1为加和作用;IR<1为拮抗作用。

1.4.2 复配剂防治烟草青枯病室内防效测定 2020年7月在中国农业科学院烟草研究所即墨基地温室内进行。供试烟草品种为青枯病感病品种红花大金元和抗病品种K326，由中国农业科学院烟草研究所遗传育种研究中心提供，育苗盘室内育苗，待烟苗长至40 d时，选择生长健康一致的烟苗移栽至装有混配营养土[细黄土∶营养基质=1∶1（V∶V）]的营养钵中（10 cm×12 cm），待苗龄55 d进行室内盆栽试验。采用拌土接种法，青枯雷尔氏菌的接种量为6.5×106 cfu/g土。在烟草移栽前，每盆撒入200 g菌土（每钵装土4 kg）。试验处理如下：①单剂噻菌铜（EC50=175.21 mg/L）;②短小芽孢杆菌AR03菌悬液（6.84×106 cfu/mL）;③复配制剂[V30%噻菌铜悬浮剂∶VAR03=5∶5];④无菌水（对照）。每处理3次重复，每重复10株烟草，灌根20 mL/株，观察对照组烟株

发病情况，始见病株后，每7 d调查1次病害发生情况，共调查3次[17]。采用国家标准GB/T 23222—2008《病害分级标准》调查各处理的病情指数，计算防效。

1.5 数据统计与分析

运用SPSS 16.0软件对数据进行单因素方差分析（ANVOA），采用LSD法进行差异显著性检验。

2 结 果

2.1 供试药剂和短小芽孢杆菌AR03对青枯雷尔氏菌的毒力分析

7种供试杀细菌剂对青枯雷尔氏菌的生长均有较好的抑制作用（表1），其毒力大小依次为三氯异氰尿酸、氯尿·硫酸铜、噻菌铜、溴菌·壬菌铜、甲霜·福美双、噻唑锌、中生菌素，EC50值介于101.02～212.70 mg/L之间。

由表2结果可知，短小芽孢杆菌AR03浓度介于1.0×105～1.0×109 cfu/mL時，对青枯雷尔氏菌的生长抑制效果明显，抑菌率介于26.13%～73.54%，呈现浓度依赖性。毒力回归方程为y=0.42x+1.55，决定系数R2=0.982，EC50值为6.84×106 cfu/mL。

2.2 短小芽孢杆菌AR03与供试药剂的相容性分析

由表3可知，7种供试药剂与AR03的生物相容性差异较大。与短小芽孢杆菌AR03相容性最差的是三氯异氰尿酸和氯尿·硫酸铜，AR03在含有100 mg/L或以上的这两种化学药剂的平板中不能生长。在含有质量浓度为100 mg/L的溴菌·壬菌铜和中生菌素的平板中，AR03可零星生长。短小芽孢杆菌AR03与噻菌铜、噻唑锌、甲霜·福美双的相容性表现较好。100 mg/L甲霜·福美双和噻唑锌对AR03生长无明显影响，但测试浓度超过150 mg/L时，AR03的生长受抑制或停止生长。噻菌铜在质量浓度200 mg/L以下，对生防菌生长抑制作用不显著。基于供试药剂对青枯雷尔氏菌的毒力以及与生防菌的相容性，选噻菌铜与AR03复配。

2.3 噻菌铜与短小芽孢杆菌AR03复配剂的室内毒力分析

复配剂的联合毒力测定结果（表4）显示具有增效作用的复配比例有V噻菌铜∶VAR03=7∶3、6∶4、5∶5、4∶6，其实际抑制率分别为53.39%、72.71%、73.92%、55.92%。其中体积比为6∶4和5∶5时，增效作用最显著，抑制效果最好，因此，复配的最佳比例选择V噻菌铜∶VAR03=5∶5。

2.4 噻菌铜和AR03复配剂防治烟草青枯病效果

从表5数据可知，噻菌铜和AR03复配剂灌根处理，烟草青枯病病情指数为10.67，要显著低于噻菌铜或短小芽孢杆菌AR03单剂处理;复配剂处理组的防效为68.77%，显著高于单剂噻菌铜和短小芽孢杆菌处理组防效（56.39%和55.22%）

3 讨 论

黄小琴等[17]研究表明硫酸链霉素、春雷霉素、氢氧化铜、噻唑锌、中生菌素、甲霜·福美双、噻菌铜对烟草青枯病的EC50值在170.07～318.57 mg/L之间，以硫酸链霉素药效最高;毕涛等[18]采用纸碟片法测定了3%四霉素水剂、72%硫酸链霉素可溶性粉剂、80%乙蒜素乳油等13种药剂对青枯雷尔氏菌的毒力作用，研究发现3%四霉素水剂抑菌效果最好;张幸等[19]选用7种杀菌剂进行烟草青枯病田间药效试验，田间防效大小依次为25%溴菌-壬菌铜微乳剂>20%噻菌铜悬浮剂>XQ生防菌剂>72%农用链霉素可湿性粉剂>4%春雷霉素。农用链霉素已在我国禁用，且上述室内毒力测定工作为5年前开展的，时效性较差。本研究采用改良抑菌圈法测定了7种已登记于青枯病防治的化学杀细菌剂对广西烟区青枯病菌的毒力作用，发现7种杀菌剂均可有效抑制病菌的生长，平均EC50值介于101.02～212.70 mg/L之间，且毒力大小依次为三氯异氰尿酸>氯尿·硫酸铜>噻菌铜>甲霜·福美双>噻唑锌>中生菌素。本研究结果与上述研究[17-19]有较大差异，可能与青枯病原菌分离地用药背景和所分离菌株有关。

近年来，生物药剂联合化学药剂协同防治作物真菌病害的相关研究报道较多，而且其协同增效作用明显，展现了生防微生物与化学杀菌剂的潜在相容性[6]。JI等[11]研究表明甲基营养型芽孢杆菌TA-1菌株与氟醚菌酰胺的相容性较好，二者复配使用对番茄灰霉菌菌丝生长的抑制效果显著高于单剂处理，且甲基营养型芽孢杆菌TA-1（108 cfu/mL）与氟醚菌酰胺（50 g/hm2）联合施用的室内防效可达到70.16%，较单剂施用组有明显提高。KIM等[20]研究表明解淀粉芽孢杆菌JCK-12菌株可增加小麦赤霉病对化学杀菌剂的敏感性，室内防效达到96.40%，田间防效达到91.00%。陈志谊等[21]研究发现芽孢杆菌能与半量的井岗霉素协同防治水稻纹枯病，并使芽孢杆菌更好地定殖在水稻上。基于化学杀真菌剂作用靶标的单一性和作用机制的特异性，生防细菌与大部分真菌杀菌剂的相容性、复合度高。然而生防细菌和杀细菌剂相容性较差，复合难度较大。目前，生防细菌与杀细菌剂复配防治细菌性植物病害的研究实例较少。PENG等[22]研究发现100 mg/L噻森铜对枯草芽孢杆菌B-001生长无影响，将枯草芽孢杆菌B-001菌株与登记用量减半的30%噻森铜悬浮剂复配对番茄青枯病的室内盆栽和大田防效均明显高于单独施用，表现出协同作用。黄小琴等[17]在烟草青枯病生防芽孢杆菌协同防治药剂的筛选和复配研究中发现，农用硫酸链霉素与解淀粉芽孢杆菌Bs2-4相容性较好，菌药联用防治青枯病的防效明显高于两者单独使用的处理，且能使化学农药减量。本研究中的革兰氏阳性生防菌短小芽孢杆菌AR03浓度高于1.0×107 cfu/mL时对青枯雷尔氏菌的室内防效在50%以上。毒力测定及生物相容性分析发现短小芽孢杆菌对甲霜·福美双、噻唑锌、噻菌铜3种供试杀菌剂耐药性强，生物相容性较好，在噻菌铜含量为200 mg/L平板中仍能正常生长，两者以5∶5的比例复配使用对烟草青枯病的室内盆栽防效达到68.77%，增效明显，同时降低化学农药使用量一半以上。菌药联用不仅可以抑制土壤生境中病原菌的生长，还可以帮助生防菌在复杂的土壤系统中定殖，形成优势种群[6]。除此之外，菌药联用可增加生防菌次生代谢物质等的分泌（挥发性物质和抗菌蛋白或酶）和增强寄主防御反应[6，23]。短小芽孢杆菌AR03菌株能够产生具有较强抑菌活性的挥发性有机物倍半萜烯类化合物，且对烟草具有较好的促生作用[12]。为此，其菌药联合增效机制如菌药联用后短小芽孢杆菌挥发性代谢产物、植物抗病性及活体竞争和定殖能力的关系等还需深入探索。同时，为了拓展其应用前景，本研究下一步将对菌药联用的田间药效展开研究。

4 结 论

本研究结果表明，7种供试杀菌剂对青枯雷尔氏菌的生长均有较好的抑制作用，毒力大小依次为三氯异氰尿酸、氯尿·硫酸铜、噻菌铜、甲霜·福美双、噻唑锌、中生菌素;短小芽孢杆菌AR03浓度为1.0×107 cfu/mL时，对青枯雷尔氏菌的抑菌率大于50%。7种供试药剂中与AR03的生物相容性较好的为噻菌铜、甲霜·福美双、噻唑锌。噻菌铜（EC50=0.625 3 μg/mL）与AR03（EC50=6.46×107 cfu/mL）复配剂在体积比5∶5时，对烟草青枯病的室内防治效果显著，增效作用明显，增效比率值IR值为1.482。

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