沉默miR-26a减轻缺血/再灌注大鼠心肌损伤

宫丹丹，隋春兴，石 晨，李 月，姜晓东

(1.大连市中心医院 心内三科， 辽宁 大连 116033； 2.大连医科大学附属第二医院 重症医学科，辽宁 大连 116027)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心血管疾病死亡的主要原因[1]，冠状动脉血流恢复(再灌注)和早期经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)是目前治疗心肌梗死最有效的方法[2]。但是，心肌血流再灌注会导致心肌细胞损伤甚至死亡，主要机制是心肌细胞氧化应激和局部炎性反应增加，这种现象被称为“缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤”。研究表明，miR-195能够针对性抑制血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)，抑制VEGFA水平可以显著促进缺血区域的血管生成[3]。目前miR-26a对I/R所致心肌细胞凋亡的影响还未见报道。本研究探讨miR-26a基因沉默对I/R心肌功能、心肌细胞凋亡和梗死面积的影响及对Rho/RhoA信号通路蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物：SPF级雄性SD大鼠60只，10～12周龄，质量260 g左右[辽宁长生生物技术有限股份公司，许可证号：SCXK(辽)2020-0001，合格证号：211002300062682]。

1.1.2 试剂：miR-26a siRNA(上海吉玛制药技术有限公司)；反转录试剂盒、RNA提取试剂盒(TaKaRa公司)；引物、RT试剂盒荧光定量PCR试剂(Western Biotechnology 公司)；兔多克隆抗caspase-3抗体、鼠单克隆抗Bax抗体、兔多克隆抗RhoA抗体、鼠单克隆抗ROCK1抗体、兔多克隆抗GAPDH抗体、山羊抗兔IgG二抗和山羊抗鼠IgG二抗(Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：用随机数表将大鼠随机分为对照组(n=20)、I/R组(n=20)和siRNA组(n=20)。siRNA组大鼠尾静脉注射4 mL/kg的miR-26a siRNA。7 d后建立大鼠心肌缺血/再灌注损伤(I/R)模型，每组大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，并将套管插入左颈动脉测量大鼠血压。使用双导联心电图仪(electrocardiogram，ECG)监测心率。然后在第四肋间切开胸腔，切除心包暴露心脏。在左心耳上方2 mm处用6-0丝线结扎左前降支冠状动脉(left anterior descending coronary artery，LAD)，诱导局部心肌缺血。缺血后30 min，丝线松解，再灌注2 h，对照组大鼠同样进行手术，但未用丝线结扎LAD。再灌注后，处死大鼠，取左室前壁心肌组织于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-26a表达：Trizol试剂提取心肌组织中总RNA，测定总RNA的浓度及纯度，A260/280在1.8～2.0提示纯度良好，可用于后续实验。定量后按试剂盒说明反转录为cDNA。然后按PCR试剂盒说明进行PCR扩增，采用2-△△Ct法计算miR-26a相对表达水平。引物序列(表1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences in RT-qPCR

1.2.3 2,3,5-三苯基四唑氯化物(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色检测心肌梗死面积：用磨具将新鲜心肌组织切成切片，-20 ℃冷冻30 min。心肌组织切成2 mm厚的切片(每个组织不超过6个切片)。然后将切片放入新鲜的TTC溶液(2%)中孵育不少于0.5 h。0.5 h后取出切片，用4%多聚甲醛固定并拍照。

1.2.4 超声心动图检测大鼠心脏功能：采用Mylab 30 CV超声系统和10 MHz线性超声换能器进行超声心动图检查，以检测各组大鼠的心脏功能。剪掉胸毛后，将大鼠麻醉并放置在37 ℃的加热板上，左侧朝上。然后检测射血分数(ejection fraction,EF%)、缩短分数(fraction shortening,FS%)和心率(heart rate,HR)。

1.2.5 苏木精-伊红(HE)染色检测心肌细胞病理结构：取心脏组织置于10%甲醛中过夜，脱水后石蜡包埋。所有心肌组织切片5 μm厚，固定于载玻片上，烘干，染色。按照说明书，切片分别用二甲苯、乙醇和苏木精浸泡，用树脂密封。干燥后在光镜下观察心肌细胞、心肌间质和肌丝的形态。

1.2.6 Western blot检测Bax、caspase-3、RhoA及ROCK1蛋白表达水平：在溶解缓冲液中充分研磨心肌组织，然后超声溶解。离心溶解缓冲液，取上清液置于离心管中。采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度，并将蛋白质样品定量至相同浓度。将蛋白质分装并置于-80 ℃冰箱中。提取总蛋白质后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将凝胶中的蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在4 ℃下与一抗孵育过夜，然后在黑暗处再次与二抗孵育1 h。设置曝光参数，进行图片采集。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-26a在心肌组织中的表达

I/R组心肌组织miR-26a表达较对照组显著上调(P<0.05)。siRNA组梗死区miR-26a的表达水平明显受到抑制(P<0.05)，表明成功诱导了miR-26a沉默大鼠模型(图1)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group图1 miR-26a在I/R心肌损伤中的表达Fig 1 Expression of miR-26a in myocardial I/R

2.2 超声心动图检查大鼠心功能变化

miR-26a沉默后，I/R引起的心脏结构异常改变明显改善。此外，miR-26a沉默使I/R损伤大鼠的FS%和EF%显著升高(P<0.05)(图2)。

2.3 miR-26a沉默对心脏病理结构的影响

I/R组心肌细胞明显水肿，肌丝排列紊乱，有不同程度的降解和坏死，并伴有炎性细胞浸润。miR-26a沉默后，心肌组织水肿明显减轻，肌丝异常也明显改善(图3)。

图3 降低miR-26a表达对心脏病理结构的影响Fig 3 Effect of decreased miR-26a expression on cardiac pathological structure

2.4 心肌梗死面积的变化

I/R组心肌梗死面积百分比高于对照组(P<0.05)，siRNA组心肌梗死面积百分比显著回降(P<0.05)(图4)。

2.5 心肌细胞凋亡水平

I/R组心肌细胞和成纤维细胞凋亡明显增加(P<0.05)，miR-26a沉默后，凋亡心肌细胞数明显回降(P<0.05)(图5)。

2.6 心肌组织凋亡相关蛋白的表达

I/R组Bax和caspase-3蛋白表达水平较对照组均明显升高(P<0.05)，siRNA组与I/R组相比Bax和caspase-3蛋白表达水平明显下降(P<0.05)(图6)。

2.7 miR-26a对心肌Rho/RhoA信号通路蛋白表达的影响

I/R组蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)，siRNA组心肌组织中RhoA和ROCK1的蛋白表达水平显著低于I/R组(P<0.05)(图7)。

3 讨论

I/R是心肌梗死或心脏手术后心力衰竭的主要原因，其特点是高发病率和死亡率[4]。快速恢复冠状动脉的正常血供是减少心肌损伤的唯一有效方法，但心脏I/R本身也会导致额外的心肌细胞死亡，进一步扩大心肌梗死面积。导致心肌I/R损伤的因素主要包括氧化应激、炎性反应和凋亡[5-7]。心肌缺血时，心肌细胞会大量消耗三磷酸腺苷从而降低肌浆网吸收Ca2+的能力， 导致线粒体中Ca2+大量积累[8]。心肌细胞I/R过程中，氧重新进入心肌细胞，导致线粒体电子传递链损伤， 从而增加活性氧(ROS)的产生。线粒体中Ca2+超载和ROS生成会促进线粒体通透性转换孔的开放，导致细胞能量代谢紊乱，最终导致不可逆的细胞坏死和凋亡[9]。上述结果表明，线粒体作为能量供应的细胞器，是细胞内重要的Ca2+缓冲系统和活性氧产生的主要来源，也是细胞存活和死亡的决定因素。因此，抑制I/R时心肌细胞凋亡、炎性反应和氧化应激，改善心肌线粒体功能，可有效逆转I/R所致的心功能不全，减少梗死面积。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group图2 各组大鼠的心脏组织结构和心功能变化(超声心动图)Fig 2 Changes of cardiac tissue structure and function of rats in each

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group图4 心肌梗死面积的变化Fig 4 Changes of myocardial infarction area

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group图5 心肌细胞凋亡水平比较Fig 5 Comparison of cardiomyocyte

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group图6 心肌组织凋亡相关蛋白的表达Fig 6 Expression of apoptosis related proteins in

细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是指在生理或病理条件下， 由基因控制的维持体内平衡的程序性死亡[10]。研究表明， 心肌梗死时多种凋亡诱导信号被激活，导致梗死区心肌细胞水肿、凋亡或坏死。心肌梗死后前6 h，心肌细胞主要以坏死的形式死亡，其后以凋亡的形式死亡[11]。在心血管领域，miRNAs被认为是调控生理和病理状态下心肌应激基因表达的关键靶点。根据先前的一项研究，miR-26a在大鼠心脏组织中大量表达，在缺血预处理中有所下降[12]。本研究发现miR-26a在I/R大鼠心肌组织中高表达，沉默miR-26a可显著改善I/R大鼠的心功能，表现为EF%和FS%均显著升高。此外，沉默miR-26a可明显降低I/R大鼠的心肌梗死面积，减少凋亡的心肌细胞数量，降低促凋亡基因Bax和caspase-3的表达。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group图7 miR-26a对心肌Rho/RhoA信号通路蛋白表达的影响Fig 7 Effect of miR-26a on the expression of Rho/RhoA signaling pathway in

最后，研究发现miR-26a可以靶向抑制Rho/RhoA信号通路中RhoA及其下游肺内高度表达的效应底物ROCK1的蛋白表达水平，因此沉默miR-26a可以激活Rho/RhoA信号通路。

综上所述，本研究首次发现，miR-26a沉默可减轻I/R引起的心脏功能障碍和心肌细胞凋亡。