液相色谱-质谱法测定动物源性食品中的三聚氰酸及其同系物

梁爱勇 / 品测（上海）检测科技有限公司

0 引言

三聚氰胺及其同系物三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺，都是重要的化工原料，本身的毒性不高，但如果被人体摄入，会引起肾结石或膀胱结石等病症，甚至引起肾衰竭，影响身体健康[1]。以三聚氰胺-甲醛树脂为原料合成的密胺餐具、食品包装材料等，经光照、加热或遇酸时，残留的三聚氰胺和三聚氰酸单体会向与之接触的食品迁移，从而污染食品，危害人体健康[2]。

目前检测三聚氰酸的分析方法很多，包括气质联用法、高效液相色谱法等[3-5]。但尚未有对动物源性食品中三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺同时进行检测的分析方法。本实验建立了测定动物源性食品中三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的高效液相色谱－串联质谱法[6-7]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂

三聚氰酸标准品：纯度大于等于99%；三聚氰酸一酰胺标准品：纯度大于等于99%；三聚氰酸二酰胺：纯度大于等于99%，均来自美国Dima Technology Inc公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，来自德国Merck试剂公司；实验用水为实验室自制的超纯水。

动物源性食品样品：液态乳、畜禽肉类加工品，均采样自上海各大超市。

1.1.2 仪器

液相质谱联用仪（ESI源）8050：日本岛津；电子分析天平XS205DU：美国梅特勒-托利多；电子分析天平PL1502-S：美国梅特勒-托利多；超声波仪2300TH：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 标准溶液的配制

三聚氰酸类标准溶液：分别称取约0.01 g（准确至0.000 01 g）的三聚氰酸类标准品于10 mL的容量瓶中，用甲醇配制成约1 000 mg/L的标准储备溶液，于4 ℃冰箱内避光保存，工作溶液逐级稀释。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

取有代表性样品，用剪刀剪碎，面积不得大于2 mm×2 mm，混合均匀，待用。

1.3.2 样品前处理

称取约0.5 g动物源性食品样品（精确至0.001 g），于10 mL离心管中，加入大约9 mL乙腈水溶液（8:2，V:V），涡旋3 min后，在超声波中超声30 min，每隔5 min振摇1次，保持固相完全分散。取出放置至室温，定量转移至25 mL容量瓶中，加乙腈水溶液（8:2，V:V）稀释至分度，混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于转速10 000 r/min，4 ℃下离心15 min，取上清液经过0.25 μm有机滤膜于进样小瓶中，进样分析。

1.3.3 样品加标提取

分别称取9个0.5 g空白动物源性食品样品，置于10 mL离心管中，加入15 μL、30 μL、150 μL三聚氰酸类混合标样后加入大约9 mL乙腈水溶液（8:2，V:V），涡旋3 min后，在超声波中超声30 min，每隔5 min振摇1次，保持固相完全分散。取出放置至室温，定量转移至25 mL容量瓶中，加乙腈水溶液（8:2，V:V）稀释至分度，混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于转速10 000 r/min，4 ℃下离心15 min，取上清液上机分析，同时做平行试验。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm×1.7 μm），流动相：A为10%乙酸铵水溶液 B为乙腈；梯度洗脱程序：0 min（87%B）→0.15 min（87%B）→2 min（55%B）→2.5 min（40%B）→5.5 min（40%B）→5.51 min（87%B）→7.5 min（87%B）；柱温箱温度：40 ℃；进样体积：5 μL；流速：0.4 mL/min。

1.3.5 质谱条件检测类型：电喷雾离子源，正负离子扫描模式（Electrospray ionization，ESI+&ESI-）；

检测方式：多反应监测模式（Multiple Reaction Monitor，MRM）；

接口温度：350 ℃；

DL温度：200 ℃；

加热模块温度：200 ℃；

雾化气流速：3.0 L/min；

加热气流速：12.0 L/min；

干燥气流速：8.0 L/min。

表1 质谱多反应监测条件

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

由三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的化学性质可知，这三种物质在高温下较不稳定，在超声波水浴提取中超声波提取过程会产生较多的热量，影响三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的稳定性。因此，本文优化了超声波提取的温度条件。

经对比试验，第一组在超声波提取过程中不控制水温，连续超声30 min；第二组在超声波提取过程中通过添加冰水，控制水温不超过20 ℃；第三组在超声波提取过程中通过添加冰水，控制水温不超过30 ℃；第四组在超声波提取过程中通过添加冰水，控制水温不超过40 ℃。

结果发现：第一组和第四组的回收率均不理想，平均回收率分别为62%和73%，而第二组和第三组的回收率均比较理想，平均回收率分别为94%和96%，因此，在超声波前处理过程中，应控制超声波的水温不得超过30 ℃。

2.2 色谱条件优化

对10.0 μg/mL的三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的标准溶液进样分析，得到三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的质谱图，见图1～3。由此可知，在设定条件下，三聚氰酸类物质虽不能较好地被分离，但可以通过不同的母离子/子离子对得到区分。

图1 三聚氰酸质谱图

图2 三聚氰酸一酰胺质谱图

图3 三聚氰酸二酰胺质谱图

2.3 标准曲线

在设定条件下，分别测定0.05 mg/L、0.5 mg/L、10 mg/L、100 mg/L 、250 mg/L三聚氰酸类标准工作溶液，以色谱峰面积（Y）为纵坐标，各组分质量浓度（X）为横坐标，绘制标准工作曲线。重复进样20次空白动物源性样品，计算其噪声的标准偏差Sb，按式（1）得到仪器检出限。

式中：b—— 标准曲线斜率

将仪器检出限乘以稀释倍数，除以称样量，结合基质干扰确定方法检出限、定量限。三聚氰酸类物质的标准曲线方程、相关系数、检出限和定量限见表2。

表2 三聚氰酸类物质的标准曲线、相关系数、检出限和定量限

2.4 加标回收试验

按1.3.3实验方法对空白动物源性食品样品进行加标回收试验，结果见表3。由此可知，平均回收率为92.7%～101.6%。

表3 加标回收试验结果

2.5 精密度试验

在空白动物源性食品样品中添加0.5 mg/kg三聚氰酸类混合标准溶液，平行测定6次，测定结果及相对标准偏差见表4。由此可知，各组分测定结果的相对标准偏差小于10%，该方法适用于动物源性食品样品中三聚氰酸类物质的定量分析，精密度良好。

表4 精密度试验结果

2.6 动物源性食品测定结果

采用本方法测定从上海各超市采样获得的6件动物源性食品样品，测定结果如表5所示。

表5 各种动物源性食品样品测定结果

由表5的测定结果可知，部分样品还是存在三聚氰酸或三聚氰酸一酰胺，分析原因可能为包装材料迁移或不法经销商添加所致。

3 结语

通过优化样品前处理方法，经过对比实验发现，控制超声波提取的水浴温度不超过30 ℃，即可得到较好的前处理效果。同时采用液相色谱-质谱联用方法对动物源性食品中的三聚氰酸类物质进行测定，三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的浓度范围均在0.05～250 mg/L内线性关系良好（r2≥0.99），加标回收率均在92.7%～101.6%之间，精密度≤10%，方法简便、快速，测定结果准确。可以用于动物源性食品中的三聚氰酸类物质的日常监测。