一种高效制备α-L-岩藻糖苷酶的方法和应用

朱泽健，张超，曾洁，张传宝

技术与方法·

一种高效制备α-L-岩藻糖苷酶的方法和应用

朱泽健，张超，曾洁，张传宝

100730 北京，北京医院/国家老年医学中心/中国医学科学院老年医学研究院/国家卫生健康委临床检验中心/北京市临床检验工程技术研究中心/（朱泽健、张超、曾洁、张传宝）；100730 北京，中国医学科学院北京协和医学院（朱泽健、张传宝）

α-L-岩藻糖苷酶（α-L-fucosidase，AFU）[EC 3.2.1.51]是一种外切糖苷酶，从细菌到哺乳动物体内都广泛存在[1]，参与多种基础生化反应。免疫化学交叉反应和纯系化研究显示，不同物种间 AFU 的氨基酸序列与结构十分相似，具有较高的保守性[2]。人体中存在高分子量（约 100 kD）和低分子量（约50 kD）两种形态的 AFU，高分子量的 AFU 是唾液酸糖蛋白，由两个低分子量的单体组成，而低分子量形式是中性的富含甘露糖的糖蛋白，两种形式都可以聚集为四聚体或六聚体形式[3]。人体内的 AFU 广泛分布于各种组织及体液中，如胎盘、胎儿组织、脑、肺、肝、胰、肾，以及血清、尿液、唾液、泪液等。从人脾脏、肝、脑和肾脏中纯化得到的 AFU 具有明显同质性，其中以肝、肾等组织活性较高，细胞内的 AFU 则主要位于溶酶体内[4]。

AFU 在临床的应用最早开始于对因先天缺乏 AFU 引起的岩藻糖苷贮积病的辅助诊断[5]。自 1984 年 Deugnier 等[6]首次报道肝细胞癌患者血清中 AFU 升高后，关于 AFU 在血清或组织中的活性改变与肿瘤发生的相关性研究也越来越多。检测血清 AFU 联合其他常规检验项目对肝细胞癌、肝内胆管癌等肝脏疾病及其他恶性肿瘤[7-9]的预后以及提高诊断灵敏度、特异度等具有积极意义。

目前临床上测定 AFU 的方法主要为 2-氯-4-硝基苯- α-L-岩藻糖苷（CNPF）速率法[10]。临床实验室使用的AFU 质控品和参考物质通常从人血清中获得，成本高，产率低。此外，大多数高值 AFU 样本来自恶性肿瘤患者，大大减少了生产来源。因此，从大肠杆菌中表达和纯化更高浓度的 AFU 可为临床实验室提供更优质、更廉价的质控品和候选参考物质。

本研究构建原核表达质粒 6His-AFU-pRSFDuet，在大肠杆菌中诱导表达并纯化。大肠杆菌是一种应用广泛的表达宿主，它以简单、快速和经济的方式生长，可高效、快速地获取高纯度 AFU。同时，6His 标签能有效地分离目的蛋白质，最终获得完整且具有生物活性的AFU。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料DH5α 菌株及BL21 Codon Plus 购买自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；质粒 pRSFDuet 由北京医院国家老年医学中心卫生部老年医学重点实验室细胞室惠赠。

1.1.2 试剂 限制性核酸内切酶R I、H I 以及 T4 DNA 连接酶购自 Thermo Fisher 公司；质粒提取试剂盒及 DNA 凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；LB 培养基预混合粉末、卡那霉素、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、聚丙烯酰胺、Tris 碱、NaCl、咪唑均购自上海生工生物股份有限公司；BCA 蛋白检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；AFU 双试剂检测试剂盒购自北京九强生物技术股份有限公司。

1.1.3 仪器设备 37 ℃恒温摇床购自苏州市培英实验设备有限公司；DNA 电泳仪和蛋白电泳仪购自北京市六一仪器厂；PCR 仪购自杭州博日科技有限公司；Ni-NTA 镍离子亲和树脂及镍离子亲和层析柱购自上海生工生物工程股份有限公司；超声细胞粉碎仪购自上海力辰邦西仪器科技有限公司；7180 全自动生化分析仪购自日本日立有限公司。

1.1.4 培养基 LB 培养基预混合粉末按照 25 g/L 溶解至超纯水中，121 ℃高压灭菌 15 min；固体 LB 培养基加入 15 g/L 琼脂。以上培养基均加入终浓度 50 μg/ml 卡那霉素。

1.2 方法

1.2.1 人组织 AFU 基因合成 从 NCBI 数据库检索获得人组织 AFU 编码序列，委托华大基因合成。

1.2.2 表达载体构建 设计引物通过 PCR 为人组织 AFU 基因 N 端增加H I 酶切位点，C 端增加R I 酶切位点。将双酶切片段插入到 pRSFDuet 载体，利用 T4 DNA 连接酶连接，并将连接产物转化DH5α 菌株，利用 Kan+抗性筛选，通过菌落 PCR 对阳性克隆进行鉴定，提取得到 6His-AFU-pRSFDuet 质粒，测序鉴定序列。

1.2.3 重组 AFU 的表达 将构建好的 6His-AFU-pRSFDuet 转化大肠杆菌BL21 Codon Plus，挑取单菌落接种至 5 ml LB 培养基 37 ℃摇床培养过夜。以 1:250 体积比将菌液接种至 250 ml LB 培养基，在 37 ℃，200 r/min培养至600= 0.6 ～ 0.8，向培养基中加入终浓度为 0.5 mmol/L的 IPTG，25 ℃、160 r/min 诱导 20 h。所有诱导后的菌液3500 r/min 离心 20 min 收集菌体，菌体重悬于 20 ml 蛋白提取缓冲液（50 mmol/L Na3PO4，pH 8.0，150 mmol/L NaCl）中，冰浴条件下使用超声细胞粉碎仪超声 6 min（超声 1 s，间隔 2 s）破碎裂解菌体，裂解产物 9500 r/min、4 ℃离心 15 min，分离上清液与沉淀。

1、2：两个单菌落的 PCR 产物；M：DNA marker

1.2.4 重组 AFU 表达条件优化 在 0.5 mmol/L IPTG，25 ℃、160 r/min 的条件下诱导 5、10、15、20、25 h；确定最佳诱导时间后，在 0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L 的 IPTG，25 ℃、160 r/min 的条件下诱导 20 h，以获得重组 AFU 诱导表达最优的时间与 IPTG 浓度。

1.2.5 重组 AFU 的纯化 将裂解上清液与 500 μl Ni-NTA 亲和树脂在 4 ℃充分混匀 1 h，用 10 mmol/L 咪唑清洗非特异性结合，最后用 250 mmol/L 咪唑洗脱重组人 6His-AFU 蛋白。

1.2.6 重组 AFU 活性检测 使用日立 7180 全自动生化分析仪搭配九强 AFU 双试剂检测试剂盒测定重组 AFU 活性。

2 结果

2.1 高效表达载体的获得

图 1A 为所用 6His-AFU-pRSFDuet 载体结构图。AFU 基因由 T7 启动子控制，在 N端融合了 6His 标记用于靶蛋白的纯化。经抗生素筛选的单菌落经菌落 PCR 扩增出约 1600 bp 的片段，与预期片段大小一致（图 1B），提取质粒送测序，经过 SnapGene 软件对比，质粒测序结果与预期的质粒图谱完全一致，表明 6His-AFU-pRSFDuet 质粒构建成功。

2.2 6His-AFU-pRSFDuet 的表达分析

将所构建的表达载体 6His-AFU-pRSFDuet 转化BL21 Codon Plus。经 LB 培养基培养及 IPTG 诱导表达后，将菌体离心、破碎，上清与镍柱亲和层析，咪唑洗脱的蛋白液经 SDS-PAGE 电泳。如图 2 所示，在亲和纯化产物中可见约 52 kD 电泳条带，大小与预期的 6His-AFU 相符，表明重组 AFU 蛋白成功表达。

1、2：超声裂解产物沉淀；3、4：超声裂解产物上清；5、6：AFU 纯化产物；M：蛋白 marker

2.3 重组AFU 表达条件优化

为提高表达效率，增加产量，对 AFU 诱导表达条件进行优化。最优诱导时间、诱导剂IPTG 浓度结果如图 3所示。从图 3B 可以看出，AFU 活性在 20 h 之后便不再增加，基于成本考虑，最优诱导时间取 20 h。从图 3D可以看出，AFU 活性在 0.1 mmol/L IPTG 诱导时最高，随 IPTG 浓度升高而降低，因此本实验最优 IPTG 浓度为0.1 mmol/L。

2.4 重组AFU 活性测定

酶的活性与其蛋白质浓度与比活密切相关。使用 BCA 蛋白检测法测定纯化后样本蛋白浓度，为 1593 mg/L。使用日立 7180 全自动生化分析仪搭配九强 AFU 双试剂检测试剂盒测定纯化后 AFU 浓度为 8820 U/L。通过计算，最终制得的重组 AFU 比活为 5.54 U/mg。

图3 不同诱导条件裂解产物上清 SDS-PAGE 电泳及活性测定[A：不同诱导时间裂解产物上清 SDS-PAGE 电泳（1 ～ 5：诱导时间 5、10、15、20、25 h；M：蛋白 marker；6：AFU 纯化产物；7：E. coli BL21 Codon Plus）；B：裂解上清液 AFU 活性随诱导时间的变化趋势；C：不同 IPTG 浓度裂解产物上清 SDS-PAGE 电泳（1：E. coli BL21 Codon Plus；2：AFU 纯化产物；M：蛋白marker；3 ～ 6：IPTG 浓度 0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L）；D：裂解上清液 AFU 活性随 IPTG 浓度的变化趋势]

3 讨论

尽管多项研究发现血清 AFU 水平的变化与多种疾病尤其是恶性肿瘤相关，但大部分疾病引起 AFU 水平变化的生理机制尚不明确。近年来有更多的研究将关注点转移到AFU 在恶性肿瘤组织中的定位与转录水平，这对 AFU 检测的临床意义和恶性肿瘤的诊断、治疗和预后都将产生重要的影响。AFU 作为单独检测的诊断指标时与多种疾病均有明显相关，但特异性并不高，若联合不同的指标或同时检测血清、尿液中的活性则可发挥比较好的指示作用。随着 AFU 的临床价值被逐渐揭示，AFU 检测结果的一致化对于疾病准确诊断具有重要意义。

目前尚无利用蛋白表达系统表达 AFU 重组蛋白的研究，获取 AFU 纯品不仅可以制备相关参考物质，也为 AFU 的临床和实验室研究奠定基础。原核表达系统作为目前应用最为广泛的蛋白表达体系，优点在于成本相对低廉，能够在较短时间内获得大量目的蛋白。本研究采用原核表达系统表达重组 AFU，在 N 端添加了 6His 标签使目标蛋白能够进行亲和纯化。临床 AFU 医学决定水平为 40 U/L，目前市面上商品化的 AFU 质控品活性大致分布在 10 ～ 40 U/L 区间。本研究最终制得的 AFU 纯品活性高达 8820 U/L，满足制备高水平AFU 参考物质的浓度需求。

近年来，临床实验室用于质量控制的参考物质通常来源于人、牛或其他动物的血清样品，成本高且制备过程复杂，并且人血清具有传播传染病的潜在风险[11]。采用大肠杆菌这一简单高效的表达系统，不仅能获得大量具有生物活性的重组 AFU，而且能够大大降低其在临床生化实验室中的应用成本。目前 AFU 这一项目没有国际公认的参考测量程序及参考物质，国内也未开展过室间质评计划，一致化领域仍处于空白。该重组 AFU 的制备能够为候选参考物质工作提供纯物质原料，为后续的研究打下基础，有潜力成为临床实验室常规 AFU 质控品及室间质评计划参考物质。

[1] Intra J, Perotti ME, Pavesi G, et al. Comparative and phylogenetic analysis of alpha-L-fucosidase genes. Gene, 2007, 392(1-2):34-46.

[2] Wu MD, Huang QC. Research progress and clinical application of α-L-fucosidase. Med Recapitulate, 2013, 19(9):1578-1580. (in Chinese)

吴曼丹, 黄前川. α-L-岩藻糖苷酶的研究进展及临床应用. 医学综述, 2013, 19(9):1578-1580.

[3] Chien SF, Dawson G. Purification and properties of two forms of human alpha-L-fucosidase. Biochim Biophys Acta, 1980, 614(2):476- 488.

[4] Huang LJ, Yao ZG. Research progress of α-L-fucosidase. Lab Med Clin, 2012, 9(15):1920-1921. (in Chinese)

黄丽君, 姚正国. α-L-岩藻糖苷酶的研究进展. 检验医学与临床, 2012, 9(15):1920-1921.

[5] Patel V, Watanabe I, Zeman W. Deficiency of alpha-L-fucosidase. Science, 1972, 176(4033):426.

[6] Deugnier Y, David V, Brissot P, et al. Serum alpha-L-fucosidase: a new marker for the diagnosis of primary hepatic carcinoma? Hepatology, 1984, 4(5):889-892.

[7] Ishizuka H, Nakayama T, Matsuoka S, et al. Prediction of the development of hepato-cellular-carcinoma in patients with liver cirrhosis by the serial determinations of serum alpha-L-fucosidase activity. Intern Med, 1999, 38(12):927-931.

[8] Waidely E, Al-Youbi AO, Bashammakh AS, et al. Alpha-l-fucosidase immunoassay for early detection of Hepatocellular Carcinoma. Anal Chem, 2017, 89(17):9459-9466.

[9] Shuang Z, Mao Y, Lin G, et al. Alpha-L-fucosidase serves as a prognostic indicator for intrahepatic cholangiocarcinoma and inhibits its invasion capacity. Biomed Res Int, 2018, 2018:8182575.

[10] Wang JJ, Cao EH. Rapid kinetic rate assay of the serum alpha-L-fucosidase in patients with hepatocellular carcinoma by using a novel substrate. Clin Chim Acta, 2004, 347(1-2):103-109.

[11] Conry-Cantilena C, VanRaden M, Gibble J, et al. Routes of infection, viremia, and liver disease in blood donors found to have hepatitis C virus infection. N Engl J Med, 1996, 334(26):1691-1696.

北京医院“科技新星”项目（BJ-2020-087）

张传宝，Email：cbzhang@nccl.org.cn

2021-01-29

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.014