草鱼Rab1A基因的克隆表达、抗体制备及对微囊藻毒素-LR的响应

何 丽 刘 林 阮记明 周 颖 梁惜梅 林长高 隗黎丽

(江西农业大学动物科学技术学院，江西 南昌 330045)

在真核生物中，小分子三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)结合蛋白家族是一类能够结合GTP的蛋白质，该家族包括Ras、Rho、Rab (ras-associated binding-GTPase)、Sar/Arf 和Ran 5 个亚家族，Rab 是其中最大的亚家族[1]，它编码的蛋白质以单体的形式存在，一般由200～210 个氨基酸组成，包含高度保守的GTPase 结构域、GTP/GDP 结合结构域和可变的N 端和C 端[2]。Rab 蛋白不仅对维持正确的细胞稳态至关重要，而且对特定的细胞功能也非常重要[3]。不同的Rabs 蛋白是突触囊泡运输的重要调节因子，在细胞增殖分子或是凋亡中发挥重要作用[4－5]。Rab 蛋白由鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor，GEFs)激活[6]，其活性受到GTP 结合形式(活性状态)和GDP 结合形式(非活性状态)的严格调控[7]，激活的Rab 蛋白通过招募外壳蛋白、激酶、磷酸酶等效应分子触发下游膜运输事件[8－9]。

在人类中发现的Rab 蛋白至少有60 种[10]，其中，Rab1A 蛋白作为Ras 超家族的一员，最初被描述为高尔基体(Golgi-resident) Rab，参与内质网到高尔基体的运输[11]。有研究表明，Rab1A 蛋白作为分子开关还可调节其他类型的细胞内转运事件，如早期内吞囊泡的运动[12]。Rab1A 蛋白作为一种高度保守的蛋白质，已在158 种不同生物体中被发现[13]，但在鱼类中报道较少[14]。草鱼(Ctenopharygodon idella)属鲤形目鲤科，是我国一种重要的淡水养殖鱼类，2018年的总产量达到了5.5×109kg，占淡水养殖鱼类总产量的21.63%[15]。近年来，由于投饵以及养殖密度的增加，极易造成养殖池塘的富营养，从而导致蓝藻水华的暴发，随之释放到水环境中的微囊藻毒素(microcystins，MCs)对草鱼会产生一定的胁迫。目前已经发现的MCs 有100 多种异构体，其中最普遍且毒性较大的为微囊藻毒素-LR (microcystins-LR，MC-LR)[16]。

前期对MC-LR 诱导后的草鱼肝脏进行转录组测序，发现Rab1A基因有差异表达[17]。在此基础上，本研究对Rab1A基因全长进行克隆、构建原核表达载体、制备多克隆抗体，并从转录水平和蛋白水平分析Rab1A经MCs 异构体中的MC-LR 诱导后的表达变化，旨在为进一步探索草鱼Rab1A基因在响应MC-LR 胁迫中的作用提供理论基础，为深入研究草鱼Rab1A 蛋白的结构和功能提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

草鱼购自江西省南昌神龙渔业公司养殖基地，体重22.13±2.17 g，体长12.09±1.33 cm。草鱼暂养于实验室中，持续充氧，水温20±0.2℃，光周期同自然光，暂养期间投喂商品饲料，日投饵量按体重的2%计算，早晚各1 次。暂养2 周后，取健康无伤的3 尾草鱼，先尾静脉取血，随后分离鳃、皮肤、肌肉、肝、脾、肠道、体肾、心脏以及头肾置于液氮中保存，用于草鱼Rab1A组织分布特征分析。随后将120 尾草鱼随机分组，包括1 个对照组和3 个处理组，每组设置3 个重复，每个重复包括10 尾鱼，经腹腔注射染毒，MC-LR剂量分别为0、25、75 和100 μg·kg－1，对照组注射等量生理盐水，试验期间没有鱼死亡。注射96 h 后，分别从各不同剂量的处理组和对照组中分别取6 尾鱼分离肝脏样品置于液氮保存，用于Rab1A基因及蛋白表达分析。

1.2 草鱼Rab1A 基因cDNA 的克隆

取出保存于液氮中的肝脏用TRIzol (美国Invitrogen 公司)提取RNA，随后用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit (美国Clontech 公司)进行反转录获得cDNA 模板。根据草鱼转录组测序的序列设计扩增草鱼Rab1A基因的PCR 引物(Rab1A-MF:5′-GACTATTT ATTCAAGCTG-3′，Rab1A-MR:5′-TCAGCAGCAGCCTCC AGA-3′)，以肝脏cDNA 模板进行PCR 扩增，获得Rab1A基因的中间片段。再根据得到的中间片段设计3′cDNA 末端快速扩增技术(rapid amplication of cDNA ends，RACE)(RC3－1:5′-CCAACGTGGAGCAGGCCTT C-3′，RC3－2:5′-ATGGGCCCCGGAGCCACAGC-3′)和5′-RACE(RC5－1:5′-GATGGTCTTTCCGTCT-3′，RC5－2:5′-TCCACACCAATAGTGCTAAT-3′，RC5－3:5′-GTGTC ATCTGCAAATCGG-3′)的特异性引物，根据SMARTTMcDNA Amplication Kit (美国Clontech 公司)的说明书进行3′RACE 和5′ RACE 扩增，分别获得3′末端和5′末端序列，再与中间序列拼接得到Rab1A基因cDNA全长序列。

1.3 草鱼Rab1A 基因cDNA 序列及系统进化分析

利用生物信息学在线工具对草鱼Rab1A基因进行分析。利用NCBI(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 查找开放阅读框(open reading frame，ORF)，并采用BLAST (http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列同源性分析，采用Expasy (http:/ /us.expasy.org/tools/protparam.Html)进行蛋白质理化性质的分析，跨膜结构和信号肽预测分别采用Phyre2(http:/ /www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) 和SignalP (http:/ /www.cbs.dtu.dk/services/SignalP－4.1)进行分析，结构域使用SMART (http:/ /smart.embl-heidelberg.de/)进行分析，氨基酸序列的比对用ClustalW1.81 软件分析。从 GenBank 下载黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)(XP027030811.1)、 电 鳗(Electrophorus electricus)( XP026873392.1 )、 斑马鱼 (Danio rerio)( NM001007161.1 )、 鲤鱼 (Cyprinus carpio)( KF737068.1 )、 非洲爪蟾 (Xenopus laevis)(AAH45014.1)、西部锦龟(Chrysemys picta bellii)(XP005287289.1)、人(Homo sapiens)(EAW99923.1)和小鼠(Mus musculus)(BAE30098.1)氨基酸序列，采用Mega7.0 软件的邻接(neighbor-joining，NJ)法构建系统发育树。

1.4 草鱼Rab1A 基因组织分布及MC-LR 对其表达的影响

取保存于液氮中健康草鱼的鳃、皮肤、肌肉、肝脏、脾脏、肠道、体肾、心脏、头肾、血液以及经不同剂量MC-LR 处理96 h 后的肝脏组织，先用TRIzol 提取RNA，采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(美国Promega 公司)进行反转录获得cDNA 模板。根据获得的草鱼Rab1A基因cDNA 序列设计荧光定量引物(Rab1A-F:5′-AAGTCTTGCCTTCTTCTCCGAT-3′，Rab1A-R:5′-ACCTCTCTTGCCCTGCTGTATC-3′)，采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRTPCR)方法检测草鱼Rab1A基因在不同组织中的表达水平以及MC-LR 染毒后的草鱼肝脏中Rab1A基因的表达变化。其中，检测Rab1A基因在不同组织中的表达的内参基因为β-actin(F: 5′-CCTTCTTGGGTAGGAG TCTTG-3′，R:5′-AGAGTATTTACGCTCAGGTGGG-3′)，分析MC-LR 对Rab1A基因表达的内参基因为甘油醛－3－磷酸脱氢酶( glyceraldehyde － 3phosphate dehydrogenase，GAPDH) (F:5′-AACTGAATCCTCTGTG TATCC-3′，R: 5′-GTCCGTTGTTGACCTCACCT-3′)，qRT-PCR 方法参考文献[18]。

1.5 草鱼Rab1A 原核表达载体构建及多克隆抗体制备

根据获得草鱼Rab1A基因ORF 序列，设计引物(F: 5′-ATGAATCCCGAATATGAC-3′，R:5′-GCAGCAG CCTCCAGATGCA-3′)，以肝脏cDNA 作为模板，进行PCR 扩增，扩增得到的产物亚克隆到pMD－18－T 并转化到大肠杆菌DH5α。经培养，取单克隆测序获得表达正确的Rab1A序列。随后选择重组表达蛋白表达载体pGEX－4T－1，对载体和Rab1A基因的序列的限制性酶切位点进行分析，选择BamHⅠ和SalⅠ作为载体构建的连接位点，在1～202 aa 这段序列内设计添加BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位点(下划线标出)的引物(F:5′-CGGTAGCCATGAATCCCGAATATGAC-3′，R:5′-ACGCGTCGACTCAGCAGCAGCCTCCAGA-3′)。分别用BamHⅠ和SalⅠ对pGEX－4T－1 和pMD－18-TRab1A双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，酶切产物经纯化后，再将Rab1A基因片段连接至pGEX－4T－1 载体，随后将连接产物pGEX－4T－1－Rab1A转化至BL21(DE3)中，挑选阳性菌落再次测序验证，获得pGEX－4T－1－Rab1A重组表达载体。将测序正确的菌液继续培养，加入0.8 mol·L－1异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-Dthiogalactopyranosidem，IPTG)在37℃诱导4 h，将诱导完的菌液超声破碎，分离上清与沉淀，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel，SDS-PAGE)分析，然后再将从上清获得的蛋白进行纯化。先后4 次皮下注射纯化的蛋白免疫新西兰兔子，于第1 次免疫52 d 后采血获得抗血清。采用酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测抗血清效价，测定时以抗原包被液作为空白对照，未免疫的新西兰大白兔血清作为阴性对照。以纯化的重组蛋白为抗原，抗血清作为一抗(1 ∶1000 稀释)，用稀释3 000倍HRP 标记山羊抗兔IgG 为二抗，采用Western blot 进行特异性检测分析。

1.6 微囊藻毒素对草鱼Rab1A 蛋白表达的影响

取保存于液氮中的经MC-LR 染毒的肝脏样品，提取蛋白。蛋白样品先用BCA 蛋白检测试剂盒(武汉塞维尔生物科技有限公司)定量，随后加入5×Loading buffer，充分混匀，沸水浴10 min 变性。蛋白样品经12%SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色。采用电转移系统转至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美国Millipore 公司)上，然后将膜浸没在5%脱脂牛奶中室温封闭2 h。采用前述方法获得的一抗[兔多抗Rab1A(1 ∶1000 稀释)，选择兔多抗GAPDH(武汉博士德生物工程有限公司)作为内参蛋白]孵育(4℃，8 h)，倒掉一抗稀释液，用吐温20 Tris 缓冲液(Tris buffered solution tween－20，TBST)洗涤3 次(每次10 min)，然后用稀释3 000 倍HRP 标记山羊抗兔的二抗(武汉塞维尔生物科技有限公司)孵育(25℃，40 min)，再用TBST 洗涤3 次(每次10 min)，最后采用增强化学发光(enhanced chemi luminescence，ECL)法显影、曝光并拍照。

1.7 数据分析

数据均以平均值±标准差表示，Rab1A基因在不同组织中的相对表达以及MC-LR 对Rab1A蛋白表达的影响均采用One-way ANOVA 分析(SPSS 16.0)，统计学显著性水平设定P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 草鱼Rab1A 基因全长cDNA 序列特征分析

根据草鱼转录组测序得到一段长约570 bpRab1A基因的序列，设计引物对该段序列进行验证并在NCBI上进行BLAST 分析，进一步确定为草鱼Rab1A基因cDNA 的中间序列，随后通过RACE 法扩增草鱼Rab1A基因的5′末端和3′末端序列，分别获得了长度为151 bp和234 bp 大小的产物。经序列拼接获得草鱼Rab1A基因cDNA 全长序列，其在NCBI 的GenBank 登录号为MG797687。草鱼Rab1A基因全长806 bp，包括5′非编码区和3′非编码区，分别为56 bp 和141 bp，ORF 为609 bp。对其编码氨基酸序列预测分析，发现草鱼Rab1A含有202 个氨基酸，分子量为22.34 kDa，理论等电点为5.93。采用signalP4.1 和Phyer2 在线分析未发现信号肽和跨膜结构。SMART 在线软件分析发现在9～172 aa处为Rab 蛋白功能结构域，也具有Rab 蛋白家族成员的5 个保守的共有序列元件，分别为GDSGVGKS (15～22 aa)、T (40 aa)、DTAG(63～66 aa)、NKCD (121～124 aa)和SAK (151～153 aa) (图1)。Rab1A基因编码的蛋白质中还存在GTP/Mg2＋结合位点，分别为D (16 aa)、GVGKSC (18～23 aa)、Y(33 aa)、NK(121～122 aa)、D(124 aa)、SAK(151～153 aa)，GDP 解离抑制因子(GDP dissociation inhibitor，GDI)作用位点包括IG(41～42 aa)、D (44 aa)、WD(62～63 aa)、F(70 aa)、T(72 aa)、TSS(74 ～ 76 aa) 和R (79 aa)，开关Ⅰ(Switch Ⅰ:YTESYISTIGVDFK，33 ～ 46 aa) 和开关Ⅱ(Switch Ⅱ:GQERFRTITSSYY，66～78 aa) (图1)。

2.2 草鱼Rab1A 氨基酸同源性与系统进化分析

草鱼Rab1A氨基酸与鲤鱼和斑马鱼Rab1A氨基酸的相似性非常高，达99%。应用MEGA7.0 软件构建的系统进化树表明草鱼Rab1A与鲤鱼、斑马鱼、黄颡鱼和电鳗等鱼类的Rab1A氨基酸聚为一大支，其中与鲤鱼的关系最近，而鸟类、哺乳动物和两栖动物等的Rab1A聚为另一大支(图2)。

2.3 草鱼Rab1A 基因组织分布特征分析

对草鱼头肾、脾脏、体肾、皮肤、肌肉、肝脏、肠道、血液、心脏以及鳃9 种组织中Rab1A基因的表达进行qRT-PCR 分析，发现草鱼Rab1A基因在所有检测的组织中均有表达，其中在血液中的表达量最为丰富，其次为鳃、心脏、肝脏和肌肉等，在头肾中表达量相对较低。以相对表达量最低的头肾作为参照进行分析，结果发现血液、鳃、心脏、肝脏和肌肉中Rab1A基因的表达量显著高于头肾中的表达量(P<0.05) (图3)。

2.4 Rab1A 重组蛋白的表达与纯化

根据克隆获得的Rab1A基因序列，构建重组表达载体pGEX－4T－1－Rab1A并转入到表达宿主菌BL21，随后采用0.8 mmol·L－1IPTG 诱导4 h，然后破菌分析蛋白表达情况，发现在50 kDa 左右位置有特异性蛋白条带(图4)。通过可溶性分析发现，该蛋白在包涵体中表达。采用不同浓度的尿素溶解，发现包涵体用8 mol·L－1尿素溶解时，可以获得大量重组蛋白。

2.5 Rab1A 蛋白多克隆抗体效价测定及其特异性检测

将纯化的pGEX－4T－1－Rab1A重组蛋白分4 次免疫新西兰大白兔(第二、三、四次免疫分别与第一次间隔12、26 和40 d)，在距离第一次免疫52 d 后，采血收集血清，获得Rab1A 蛋白的多克隆抗体。对获得的Rab1A多克隆抗体血清采用ELISA 进行效价测定，结果显示，多克隆抗体的效价达1 ∶512 000 以上(图5)。采用Western blot 方法进行抗原检测，得到一条约50 kDa 的目的条带，同时也发现有些小于50 kDa 的非特异性条带，然而随着一抗浓度的下降，非特异条带也逐渐减少(图6)。

2.6 微囊藻毒素-LR 对草鱼肝脏Rab1A 基因和蛋白表达的影响

分别采用qRT-PCR 和Western blot 检测Rab1A基因和蛋白的表达变化，结果发现Rab1A基因和蛋白的表达在100 μg·kg－1剂量组中显著被抑制(P<0. 05)，其他剂量组中其表达变化不显著(P>0. 05) (图7)。

3 讨论

本研究从草鱼肝脏组织中克隆得到Rab1A基因cDNA 全长，经在线分析可知草鱼Rab1A 氨基酸含有1 个Rab 结构域和5 个G box 结构(G1-G5 box)，其中G1 box 是一个磷酸结合环(P-loop)，G2 box 由苏氨酸残基组成，这个区域与开关Ⅰ区域重叠，称为效应区域[19]。另外，G3 box 与开关Ⅱ区域重叠[20]。Rab 结构域是Rab 蛋白家族共有的保守区，G 结构域是GTP结合和水解区域[21]，分析发现草鱼Rab1A 具有GTP/GDP 和Mg2＋作用位点，这与之前的报道相似[22－23]，表明草鱼Rab1A 符合Rab 蛋白家族保守的特征。此外，草鱼Rab1A 的C 末端为CC 模式，符合已报道的C 末端的最末几个氨基酸的几种模式(C、CC、CXC、CCXX、CXXX 和CCXXX 型)[1]。根据NCBI 数据库的数据进行氨基酸同源性分析，草鱼Rab1A与鲤鱼等鱼类的Rab1A聚为一类，并且与鲤鱼等Rab1A的相似性达到了99%。上述结果说明克隆所获得草鱼Rab1A属于Rab 家族，且Rab1A保守性非常高。

大多数Rab 蛋白没有组织特异性，如Rab6A在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的心脏、肝胰腺、肠道、胃、鳃、肌肉和血液等组织中的表达没有明显的组织特异性，但在肝胰腺中的表达量比其他组织高[24]；Rab11 在罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的肝胰腺、肌肉、肠道等组织中的表达量相对较高，在鳃、心脏、胃、血液等组织中少量表达，没有明显组织特异性[25]。Zhao 等[14]通过荧光定量检测分析发现鲤鱼4种Rab1A剪接异构体(Rab1A1、Rab1A2、Rab1A3 和Rab1A4)在脑、皮肤、鳃、血液、肾脏、肌肉、肝脏、脾脏、肠道和心脏中都有表达，其中鲤鱼Rab1A3 和Rab1A4在鳃、肾、皮肤、血液和脑中的表达高于肝、脾、肠、心脏和肌肉中的表达，尤其在鳃中的表达量高，而鲤鱼Rab1A1 在血液中的表达量最高，鲤鱼Rab1A2 在肝脏中的表达量最高。本研究发现草鱼Rab1A在血液、鳃中的表达量相对较高，与鲤鱼Rab1A3 的表达方式有一定的相似[14]，这可能与草鱼Rab1A和鲤鱼Rab1A3的同源关系近有关。今后可进一步研究草鱼Rab1A的剪接异构体，了解其不同间接异构体的组织表达特征以及其功能差异等。

草鱼Rab1A经克隆和重组表达后，获得重组表达蛋白分子量约为50 kDa (其中载体的分子量为27 kDa)，因此，构建的重组蛋白表达正确，这为后期功能研究奠定了基础，但本研究制备的多克隆抗体有一些非特异性条带，随着一抗浓度的下降，非特异条带也逐渐减少甚至消失，这说明制备的抗体的特异性可以满足试验需要。囊泡运输是细胞内物质运输的重要方式，目前研究发现，Rab 蛋白作为囊泡运输的分子开关，在囊泡的形成、转运、粘附、锚定和融合等过程中起着重要作用[26－27]。Rab1A除了具有囊泡运输功能之外，在信号传导[28]、细胞迁移[29]、自噬调节[30]以及癌症的发生[31]等方面均具有重要作用。此外，Rab 基因在应激反应中也具有潜在作用，如在细菌感染[32]和污染物暴露等情况下[33]。对草鱼Rab1A的结构分析结果表明其高度保守，这也说明草鱼Rab1A蛋白可能也具有其他物种Rab1A的功能。

近年来，活性氧(reactive oxygen species，ROS)在MC-LR 诱导的细胞凋亡中所起的重要作用已有较多报道[34－35]，Rab 蛋白与ROS 之间的相互作用也引起了人们的关注。Rab 蛋白似乎可以调节ROS 的产生和消除，有报道表明Rab 蛋白可通过清除ROS，从而在植物的胁迫应答中发挥作用[36]，同时，ROS 也是GTPases 的上游调节因子[37]，对Rab 蛋白起到一定的调节作用。较多证据表明，MC-LR 可以诱导ROS 的产生并且可通过调节PP1 和PP2A 的活性来干扰氧化还原平衡从而诱导机体细胞凋亡的产生[38－40]。本研究通过qRT-PCR 以及Western blot 检测分析发现MC-LR诱导草鱼96 h 后，肝脏中Rab1A基因和蛋白的表达在MC-LR 25 和75 μg·kg－1剂量组变化不显著(P>0.05)，但在100 μg·kg－1剂量组中的草鱼肝脏Rab1A显著下调(P<0.05)。本研究前期通过TUNEL 等方法发现100 μg·kg－1剂量的MC-LR 可显著诱导肝脏细胞凋亡的产生[41]。这说明高剂量的MC-LR 可能通过抑制Rab1A的表达促进ROS 的产生，从而引起细胞凋亡，但这种推测还需要开展Rab1A干扰实验等进一步验证。

4 结论

本研究克隆了草鱼Rab1A基因，系统分析了其序列特点、组织表达特征，显示草鱼Rab1A基因保守性强且在血液中表达高。制备的多克隆抗体效价高且有较好的特异性，可用于相关的检测研究。此外，较高剂量的MC-LR 可抑制Rab1A基因和蛋白的表达，提示Rab1A在草鱼应对MC-LR 胁迫时参与了反应。本研究为后续深入探讨Rab1A的功能以及在MC-LR 胁迫过程中的作用机制提供了参考。