烟嘧磺隆胁迫对甜玉米幼苗活性氧积累、抗氧化系统及相关基因表达的影响

杨 敏 李向岭 韩金玲 杨 晴 王 健

(河北科技师范学院农学与生物科技学院/河北省作物逆境生物学重点实验室，河北秦皇岛 066004)

中国是世界第二大甜玉米(Zea maysL. seccharata Sturt)生产国，甜玉米市场具有良好的发展前景。为迎合市场需求，玉米的品种选育逐渐向籽粒高含糖量方向发展。Robinson 等[1]研究表明，甜玉米籽粒的高含糖量必将降低种子活力，较低的种子活力导致群体冠层生长发育缓慢，无法应对田间日益激烈的杂草竞争。因此，使用除草剂控制田间杂草是甜玉米生产的必然选择。烟嘧磺隆(nicosulfuron)是一种磺酰脲类内吸传导型除草剂，可通过植物的根、茎、叶吸收，并经木质部和韧皮部向上和向下传导，其通过抑制敏感性杂草体内乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)的活性，阻碍缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸的合成，进而抑制细胞分裂，使杂草紫化、黄化、退绿，最终死亡[2－3]。自1999年，美国一些地区批准烟嘧磺隆作为甜玉米苗后除草剂使用以来，国内外开展了大量甜玉米自交系和杂交种对烟嘧磺隆安全性的评估工作[4－5]。研究表明，甜玉米对烟嘧磺隆表现出较强的敏感性，敏感程度依次为普甜型玉米<加强甜型玉米<超甜型玉米[6－7]。甜玉米新品种对烟嘧磺隆耐药性的鉴定工作仍在持续进行中。

在自然和环境压力条件下，光系统Ⅰ(photosystemⅠ，PSI)、光系统Ⅱ(photosystem Ⅱ，PSⅡ)和线粒体参与的电子传递过程是活性氧(reactive oxygen，ROS)产生的主要场所[8]。烟嘧磺隆可以通过相同的电子传递系统促进ROS 的产生，从而加速植物体的生理生化损伤。抗氧化系统在清除植物体内ROS 和防止除草剂胁迫引起的植物细胞损伤方面扮演着重要角色[9－10]。张定一等[11]研究表明，小麦叶片喷施除草剂后，叶片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性上升，活性氧自由基维持在较低水平，随生育进程推进，当叶片合成的SOD 不足以将除草剂药害产生的清除时，SOD 活性下降，过氧化物质积累增加，细胞膜系统遭到破坏。同时，大量研究表明，植物细胞中产生的ROS 可以调控抗氧化系统相关基因的表达[12－13]。Zhang 等[14]研究表明，Cu/Zn-SOD基因在转基因烟草植株中的过表达能增强烟草植株对干旱、低温和氧化胁迫的耐受性。Sytykiewicz[15]研究表明，蚜虫侵染玉米叶片使GR1 和GR2 基因显著上调。

在应对各种环境压力时，植株体内ROS 的产生、抗氧化酶活性及关键酶基因的调控已被广泛报道。但甜玉米体内ROS 的积累、抗氧化系统及其基因家族对烟嘧磺隆胁迫的响应机制尚鲜有报道。前期研究表明，在玉米四叶一心期喷施40 g·L－1烟嘧磺隆可分散油悬浮剂(有效成分为36 g·hm－2)时，导致植物体内的氧化还原反应失衡，使植物体内的氧化压力不断加剧[14]。在此基础上，本研究以对烟嘧磺隆表现不同耐药性的一对甜玉米姊妹系为试材，探究烟嘧磺隆胁迫对甜玉米幼苗ROS 积累、抗氧化系统及关键酶基因表达的影响，旨在为增强甜玉米耐药性，实现甜玉米高产栽培提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为一对甜玉米姊妹系HK301 和HK320，由河北科技师范学院选育，HK301 对烟嘧磺隆表现为耐药，HK320 对烟嘧磺隆表现为敏感。

试验药剂为40 g·L－1烟嘧磺隆可分散油悬浮剂，日本石原产业株式会社生产。

1.2 试验设计

2018―2019年，于河北科技师范学院昌黎县试验站对HK301 和HK320 进行了2年的田间喷施烟嘧磺隆浓度筛选试验。在玉米四叶一心期，采用背负式电动喷雾器喷施烟嘧磺隆，喷施浓度为0、9、18、36、54、72、90、108、126 和144 g·hm－2。当喷施浓度为生产中使用浓度36 g·hm－2时，耐药性自交系HK301 幼苗可以正常生长，敏感自交系HK320 幼苗全部死亡[16]，后续试验选择36 g·hm－2为田间喷施烟嘧磺隆浓度。

2019―2020年，于河北科技师范学院昌黎县试验站进行大田试验和温室盆栽试验。大田试验采用随机区组设计，3 次重复，小区面积36 m2。设置药剂喷施浓度定为36 g·hm－2，并以喷施清水为对照。在玉米四叶一心期时喷药，分别在喷药后0、1、3、5、7 d 采集不同处理的叶片样品置于液氮中，保存于－80℃冰箱，用于ROS 含量、抗氧化酶活性和非酶类物质的测定。温室盆栽试验处理设置与大田试验相同，每个处理10盆。Liu 等[17]研究表明，喷药后24 h 是玉米对除草剂响应的最佳时间，因此，在喷药24 h 后取样，用液氮速冻，将样品保存于－80℃冰箱，用于基因表达量的测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 过氧化氢含量、超氧阴离子产生速率和丙二醛含量测定 根据Jena 等[18]的方法测定过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)含量；根据Jiang 等[19]的方法测定超氧阴离子自由基(superoxide anion，产生速率； 利用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.2 抗氧化酶活性测定 根据Yu 等[20]的方法测定SOD 活性；根据Vaculíkova 等[21]的方法测定过氧化氢酶(catalase，CAT)活性；根据Boominathan 等[22]的方法测定单脱氢抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbate reductase，MDHAR)活性；根据Yu 等[23]的方法测定抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase，DHAR)活性；根据Bian 等[24]的方法测定谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)活性。

1.3.3 非酶物质含量测定 根据Queval 等[25]的方法测定还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)和氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide，GSSG)含量；根据Gossett等[26]的方法测定抗坏血酸(ascorbate，ASA)和脱氢抗坏血酸(dehydroascorbate，DHA)含量。

1.3.4 基因表达量测定 SOD、 CAT、 APX、MDHAR、DHAR 和GR 酶基因序列通过www.maizegdb.org 和www.ncbi.nlm.nih.gov/获得。根据数据库中的基因序列利用Primer Premier 5 设计基因引物，在NCBI 上进行引物序列比对，保证其专一性，内参基因为GADPH(详见表1)。采用TaqSYBR® Green qPCR测试盒(TaKaRa，日本) 进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)。采用2－ΔΔCT法计算目标基因相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 数据处理与分析

采用 Microsoft Excel 2007 进行数据整理，SPSS 12.0 软件进行方差分析，SigmaPlot 12.5 进行作图。

2 结果与分析

2.1 活性氧积累及脂质过氧化

2.1.2 H2O2含量 由图1-C 和1-D 可知，HK301 幼苗中的H2O2含量在烟嘧磺隆胁迫1 d 时与对照相比无显著差异；烟嘧磺隆胁迫3 d 时，较对照提高31.51%，差异达到显著水平，随后呈下降趋势，并在烟嘧磺隆胁迫5 d 时分别较对照显著降低15.86%和17.24%。HK320 的H2O2含量随烟嘧磺隆胁迫时间的延长呈明显上升的趋势；烟嘧磺隆胁迫7 d 时，HK320 的 H2O2含量达到最大值，较对照提高175.09%，差异达到显著水平。

2.1.3 MDA 含量 由图1-E 和1-F 可知，烟嘧磺隆胁迫后，HK301 和HK320 的MDA 含量均较对照有所增加。但随胁迫时间的延长，HK320 的MDA 含量持续增加，而HK301 的MDA 含量则呈下降趋势。烟嘧磺隆胁迫1、3 和5 d 时，HK301 的MDA 含量分别较对照增加了16.59%、28.47%和42.59%，差异达到显著水平。烟嘧磺隆胁迫1、3、5 和7 d 时，HK320 的MDA含量分别较对照增加了45.20%、206.54%、181.67%和250.38%，差异达到显著水平。

2.2 抗氧化酶活性

2.2.1 SOD、CAT 和APX 活性的变化 由图2-A 可知，烟嘧磺隆胁迫显著提高了HK301 的SOD 活性。烟嘧磺隆胁迫1、3 和5 d 时，HK301 的SOD 活性分别较对照显著提高了124.75%、155.16%和60.67%；至烟嘧磺隆胁迫7 d 时，HK301 的SOD 活性恢复至对照水平。由图2－B 可知，烟嘧磺隆胁迫1 d 时，HK320 的SOD 活性与对照无显著差异，随着烟嘧磺隆胁迫时间的延长，HK320 的SOD 活性较对照显著下降；在烟嘧磺隆胁迫3、5 和7 d 时，分别较对照降低47.89%、48.79%和56.15%。

由图2-C 和2-D 可知，烟嘧磺隆胁迫下，HK301 和HK320 的CAT 活性均在胁迫1 d 时达到最大值，随着胁迫时间的延长，HK301 的CAT 活性有所下降但仍显著高于对照；HK320 的CAT 活性呈持续下降的趋势。在烟嘧磺隆胁迫1、3、5 和7 d 时，HK301 的CAT 活性分别较对照显著提高268.75%、152.47%、173.92%和105.71%。在烟嘧磺隆胁迫1 和3 d 时，HK320 的CAT 活性分别较对照显著提高162.02%和72.33%，烟嘧磺隆胁迫5 d 时恢复至对照水平，胁迫7 d 时显著低于对照。

由图2-E 和2-F 可知，烟嘧磺隆胁迫3 d 时，HK301 的APX 活性达到最大值，随着胁迫时间的延长，APX 活性有所下降但始终显著高于对照。相比之下，烟嘧磺隆胁迫1 d 时，HK320 的APX 活性达到最大值，且显著高于对照，随着胁迫时间的延长，呈下降趋势，至胁迫3 d 时，HK320 的APX 活性与对照无显著差异，随后显著低于对照，至胁迫5 和7 d 时，分别较对照降低37.81%和45.76%。

2.2.2 MDHAR、DHAR 和GR 活性的变化 由图3-A和3-B 可知，烟嘧磺隆胁迫显著提高了HK301 的MDHAR 活性。烟嘧磺隆胁迫1、3、5 和7 d 时，HK301的MDHAR 活性与对照显著提高57.63%、91.12%、63.72%、33.24%。而烟嘧磺隆胁迫1 和3 d 时，HK320 的MDHAR 活性较对照无显著差异；烟嘧磺隆胁迫5 和7 d 时，HK320 的MDHAR 活性呈下降趋势，分别较对照显著降低48.80%和50.29%。

由图3-C 和3-D 可知，烟嘧磺隆胁迫3 d 时，HK301 的DHAR 活性达到最大值，随后呈下降趋势，但仍显著高于对照。烟嘧磺隆胁迫1 d 时，HK320 的DHAR 活性达到最大值，且显著高于对照，随后呈持续下降趋势；烟嘧磺隆胁迫5 和7 d 时，HK320 的DHAR活分别较对照显著降低28.84%和37.69%。

由图3-E 和3-F 可知，烟嘧磺隆胁迫显著增加了HK301 的GR 活性。烟嘧磺隆胁迫1、3、5 和7 d 时，HK301 的GR 活性分别较对照显著提高96.34%、277.52%、193.63%和233.02%。HK320 的GR 活性在烟嘧磺隆胁迫1 d 后达到最大值，之后随着胁迫时间的延长，呈持续下降的趋势。烟嘧磺隆胁迫1 d 时，HK320 的GR 活性较对照显著提高61.23%；胁迫3 和5 d 时，HK320 的GR 活性与对照无显著差异；胁迫7 d时，HK320 的GR 活性较对照显著降低54.00%。

2.3 抗氧化系统非酶类物质含量

2.3.1 AsA、DHA 含量及AsA/DHA 比值的变化 由图4-A 和4-B 可知，烟嘧磺隆胁迫下，HK301 和HK320的AsA 含量均在胁迫1 d 时达到最大值，之后随着胁迫时间的延长呈下降趋势。烟嘧磺隆胁迫3 和5 d时，HK301 的AsA 含量较对照显著提高66.61%和44.21%；胁迫7 d 时，HK301 的AsA 含量与对照无显著差异。烟嘧磺隆胁迫1 d 时，HK320 的AsA 含量显著高于对照；至胁迫5～7 d 时，HK320 的AsA 含量显著低于对照。

由图4-C 和4-D 可知，烟嘧磺隆胁迫1 和3 d 时，HK301 的DHA 含量分别较对照显著提高96.33%和54.52%，至胁迫5～7 d 时，下降至对照水平。随烟嘧磺隆胁迫时间的延长，HK320 的DHA 含量迅速升高，胁迫5 d 时达到平稳状态；其中胁迫1、3、5 和7 d 时，HK320 的 DHA 含量较对照分别提高51.02%、96.33%、120.20%和112.85，差异达到显著水平。

由图4-E 和4-F 可知，除烟嘧磺隆胁迫1 d 时，HK301 的AsA/DHA 比值显著高于对照，在其他时间点，HK301 的AsA/DHA 比值较对照未发生明显改变。HK320 的AsA/DHA 比值随着烟嘧磺隆胁迫时间的延长呈下降趋势。烟嘧磺隆胁迫1 d 时，HK320 的AsA/DHA 比值较对照未发生显著变化；烟嘧磺隆胁迫3～7 d 时，HK320 的AsA/DHA 比值显著低于对照。

2.3.2 GSH、GSSG 含量及GSH/GSSG 比值的变化由图5-A 和5-B 可知，HK301 的GSH 含量在烟嘧磺隆胁迫3 d 时达到最大值，随后呈下降趋势，但仍显著高于对照；其中胁迫1、3、5 和7 d 时，HK301 的GSH 含量分别较对照显著提高35.61%、164.95%、113.55%和69.81%。HK320 的GSH 含量在烟嘧磺隆胁迫1 d时达到最大值，随后呈下降趋势，且显著低于对照；烟嘧磺隆胁迫3、5 和7 d 时，HK320 的GSH 含量分别较对照显著降低18.24%、52.95%和58.66%。

由图5-C 和5-D 可知，随着烟嘧磺隆胁迫时间的延长，HK301 的GSSG 含量呈持续上升的趋势，在胁迫7 d 时达到最大值，且在胁迫1 ～ 7 d 时，HK301 的GSSG 含量均显著高于对照。除胁迫1 d外，HK320 的GSSG 含量在其他时间点较对照均未有明显的改变。

由图5-E 和5-F 可知，烟嘧磺隆胁迫1 d 时，HK301 的GSH/GSSG 比值较对照显著降低；胁迫3 d 时，HK301 的GSH/GSSG 比值较对照显著提高42. 21%；随后呈下降趋势，且在胁迫的5～7 d 时显著低于对照。HK320 的GSH/GSSG 比值仅在胁迫1 d 时显著高于对照，在胁迫3～7 d 时均显著低于对照。

2.4 抗氧化酶关键基因表达量

2.4.1 SOD 和CAT 家族基因表达量的变化 由表2可知，烟嘧磺隆胁迫24 h 时，相较于各自对照，HK301的SOD1、SOD3.4 和SOD9 基因相对表达量显著上调，SOD2 基因相对表达量轻微下调，CAT1 和CAT2 基因相对表达量显著上调；HK320 的SOD1、SOD2 和SOD9基因相对表达量显著下调，SOD3.4 基因相对表达量轻微上调，CAT2 基因表达量显著下调。

表2 烟嘧磺隆处理对甜玉米苗期叶片SOD 和CAT 家族基因表达量的影响Table 3 Effects of nicosulfuron on the expression level of antioxidant enzymes related genes in the leaves of maize seedling

2.4.2 AsA-GSH 途径关键酶基因表达量的变化 由表3 可知，烟嘧磺隆处理显著影响AsA-GSH 途径关键酶基因的表达水平。烟嘧磺隆胁迫24 h 时，与各自对照相比，HK301 的APX1、APX2 和APX4 基因相对表达量显著上调；而HK320 的APX2、APX3 和APX4 基因相对表达量显著下调。烟嘧磺隆处理显著提升了HK301 的MDHAR1 和MDHAR2 基因的相对表达水平。相比于HK320-CK，HK320 的MDHARs 基因未发生显著变化。烟嘧磺隆处理显著提升了HK320 的DHAR1和DHAR2 基因的相对表达水平。相比于各自对照，HK301 的DHAR1 和DHAR2 基因的表达水平分别上调了2.72 和2.63 倍；HK320 的DHAR1 基因相对表达量显著下调，DHAR2 基因相对表达量无显著变化。两自交系的GRs 基因也对烟嘧磺隆处理表现出了强烈响应。烟嘧磺隆胁迫后，相比于各自对照，HK301 的GR1 和GR2 基因相对表达量显著上调；HK320 的GR1基因显著上调，GR2 基因显著下调。

表3 烟嘧磺隆处理对甜玉米苗期叶片AsA-GSH 途径关键酶基因表达量的影响Table 3 Effects of nicosulfuron on the expression level of antioxidant enzymes related genes in the leaves of maize

3 讨论

本研究前期结果表明，烟嘧磺隆胁迫下敏感性自交系叶片电子传递速率降低，PSI 和PSⅡ系统遭到破坏，导致电子传递载体过度还原，使得电子向O2不断传递形成[16]，而可通过SOD 歧化作用转化为H2O2[27]。本研究结果表明，烟嘧磺隆胁迫下，相较于耐药型甜玉米自交系HK301，敏感型甜玉米自交系HK320 的产生速率随着胁迫时间的延长持续增加。另外，由于HK320 叶片低水平的SOD 和CAT 活性导致不能被及时清除，最终转化为大量的H2O2。本研究与Alla等[28]的研究结果相一致。过量的H2O2将导致植物体内膜脂过氧化，脂质过氧化诱导植物体内MDA 的积累[29－30]。本研究表明，相较于HK301，HK320 叶片中的MDA 含量增加明显，可见，随着胁迫时间的延长，HK320内体的氧化压力不断加剧。

在植物的叶绿体和其他细胞器中，H2O2能被快速分解转化[31]。在AsA-GSH 代谢途径中，H2O2经APX的催化作用最终转化为H2O[27]。本研究结果表明，烟嘧磺隆胁迫下，HK320 的APX 活性显著低于HK301(P<0.05)。Miyaka 等[32]研究表明，植物体内的AsA含量缺失或处于较低水平是导致APX 活性不稳定的重要因素。烟嘧磺隆胁迫5～7 d 时，HK320 的AsA 含量显著低于对照。推测HK320 中，低水平的APX 活性可能是由于低水平的AsA 含量造成的。此外，在MDHAR 的催化下，AsA 通过氧化反应形成MDHA，MDHA 通过歧化作用生成DHA，在DHAR 的催化下，DHA 被还原为AsA[33]。本研究结果表明，HK320 在烟嘧磺隆胁迫5～7 d 时DHAR 活性较对照显著降低，可能会导致AsA 稳态改变，最终使AsA/DHA 比值降低。Bartoli 等[34]研究表明，AsA 的再生需要NADPH作为MDHAR 的电子供体，并且AsA 和光合电子传递链之间存在直接作用，因此，烟嘧磺隆对光电子传输链的破坏作用可能是AsA 含量降低的另一重要原因。

谷胱甘肽(GSH)作为一种重要的低分子量抗氧化剂在清除H2O2过程中具有重要的作用[35]。本研究表明，烟嘧磺隆胁迫下，HK301 的GSH 含量显著高于对照，相比之下，HK320 在胁迫3～7 d 时GSH 含量显著低于对照。同时，HK301 的GR 活性显著高于HK320，并能维持较高的GSH/GSSG 比值(P< 0.05)。可能是由于HK301 中GR 活性的提高加速了GSH 的转化，从而有利于植物体内H2O2的清除。

SOD 与超氧化物淬灭为H2O2密切相关，目前已发现植物体中存在3 种类型的SOD(Cu/Zn、Fe 和Mn SOD)[36]。同时，研究表明，在干旱、重金属和高温等环境胁迫下会导致SOD 活性发生显著变化[37－39]。本研究中，烟嘧磺隆胁迫下，尽管HK301 的SOD 活性显著升高，但其3 种亚型的转录水平对烟嘧磺隆胁迫表现出不同的响应。烟嘧磺隆胁迫24 h 后，相较于对照，HK301 的Cu/Zn SOD1、Mn SOD3.4 和Cu/Zn SOD9 基因相对表达量显著上调，Fe SOD2 基因相对表达量轻微下调。相比之下，HK320 的Cu/Zn SOD1、Fe SOD2 和Cu/Zn SOD9 基因相对表达量较对照显著下调，Mn SOD3.4 基因相对表达量轻微上调。大量研究表明，Cu/Zn SOD比Fe SOD和Mn SOD对植物体内氧化应激响应更为敏感[40]。本研究证明，相较于Fe SOD和Mn SOD，Cu/Zn SOD对烟磺隆诱导的氧化应激反应更强。

AsA-GSH 途径在非生物胁迫诱导的氧化应激中扮演着重要的角色[41－42]。本研究表明，不同类型玉米品种的APXs 基因对烟嘧磺隆处理存在响应差异。烟嘧磺隆胁迫24 h，相比各自对照，HK301 的APX1、APX2 和APX4 基因相对表达量显著上调；而HK320的APX2、APX3 和APX4 基因相对表达量显著下调。说明单独的基因在特定的环境条件下存在响应差异。MDHAR 是AsA-GSH 途径中的第2 种酶，在一系列非生物胁迫中其活性均显著上调，在防止植物体内氧化还原反应失衡过程中起到重要作用[43]。本研究表明，与各自对照相比烟嘧磺隆处理显著增加了HK301 的MDHAR1 和MDHAR2 基因相对表达水平，而HK320 的MDHARs基因相对表达水平未发生显著变化。说明耐药性自交系HK301 更积极地调动了体内的MDHARs基因来抵抗除草剂诱导的氧化压力。DHAR过表达能增强植物对多种氧化压力的抵抗作用[44]。本研究表明，相比于各自对照，HK301 的DHAR1 和DHAR2 基因相对表达量显著上调，HK320 的DHAR1 基因显著下调，DHAR2 基因未发生显著变化，说明相较于DHAR2基因，DHAR1 基因在烟嘧磺隆诱导氧化压力解毒过程中起到更积极的作用。GR 在调节多种非生物胁迫中起重要作用，GR基因的过表达增强了植物对重金属、盐和干旱胁迫的耐受性[45－47]。本研究表明，烟嘧磺隆胁迫下，相比于各自对照，HK301 的GR1 和GR2 基因相对表达量均显著上调；HK320 的GR1 基因显著上调，GR2 基因显著下调。可见GRs在抵抗烟嘧磺隆胁迫中具有重要作用。

4 结论

烟嘧磺隆胁迫下，相较于耐药性品种HK301，敏感性品种HK320 不能将植株体内的烟嘧磺隆快速降解，使其诱导植物体产生氧化应激反应，导致HK320体内的ROS(和H2O2)积累量显著增加，引起脂质过氧化；且由于HK320 抗氧化系统的防御能力降低，在抗氧化系统关键酶基因家族的调控下，HK320 的酶类物质(SOD、CAT、APX、MDHAR、DHAR 和GR)活性总体显著下降，非酶类物质(AsA、DHA、GSH 和GSSG)含量总体显著降低。本研究结果证明在不同耐药性甜玉米品种中，抗氧化酶系统和关键酶基因的表达对响应除草剂胁迫、清除植株体内的ROS 起着重要作用。